胚胎干细胞

胚胎干细胞的发现并非偶然，而是在发育生物学领域科学研究的铺垫下诞生的。“干细胞”一词于1908年在柏林血液学会大会上由亚历山大·马克西莫夫（Alexander Maximov）引入医学领域，当时他指的是造血细胞。早在多能胚胎干细胞稳定系分离和生产之前，畸胎干细胞（胚胎癌干细胞）就已用于早期发育过程的研究，并借助这些干细胞研究胚胎发生的未知机制，包括早期基因的表达序列及其活性蛋白产物。

但人类基因组的全能性在进化过程中真的会不可挽回地丧失吗？不会，胚胎发生就是明证。如果真是这样，那么原则上，第二条进化发展路径何时才能实现呢？或许，当人类进入太空时，那里的环境条件会在足够长的时间内保持相对恒定。骨组织的流失（失重状态下骨骼的脱矿）可以非常缓慢地重塑和再生，这可以被认为是人类作为一个物种适应太空生存的第一步。然而，第二条进化发展路径的代价将有所不同——恢复所有细胞的全能性和绝对可塑性的代价将是无菌性。因此，在这个“进化变色龙”的世界里，我们将不得不通过出芽繁殖，而无需减数分裂。但我们将能够长寿。端粒酶的永生，就如同变形虫的永生一样。在多细胞生物中，干细胞是数量和质量长寿的基础。

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

胚胎干细胞的来源

目前，实验室研究中胚胎干细胞的来源包括小鼠畸胎瘤细胞系（129/sv、F19、F8、Zin 40、CGR 86、R1、CCE、JM-1、E14TG2a、CGRSb）和人类畸胎瘤细胞系（NTERA-2、TERA-2、H-9克隆），以及Trauneon胚胎干细胞系。然而，即使拥有详细的细胞护照（显示免疫表型）、染色体分析结果、mRNA表达谱、暴露的受体和胞内信号传导蛋白，也无法弥补畸胎瘤胚胎干细胞系的显著缺陷——全能性迅速丧失，无法用于临床试验；此外，由于培养过程中存在混合分化，从异质细胞群中分离出纯正的特化细胞系也十分困难。因此，临床上建立的ESC系的来源通常是囊胚的内细胞团、8细胞期胚胎的单个胚泡、后期的桑葚胚细胞以及原始生殖细胞。

需要注意的是，畸胎癌细胞虽然具有多能性，但其多能性潜能显著低于胚胎干细胞。它们与胚胎细胞的整合很少导致嵌合体的形成，而且嵌合体也永远不会形成具有畸胎癌细胞基因型的配子。人们认为，这是由于畸胎癌细胞在培养过程中经常发生染色体异常：Y染色体丢失、各种三体性、缺失或易位。

人们曾多次尝试分离人类 ESC 系，但由于正常的人类囊胚难以获取，这一任务一直未能解决。此外，人类染色体异常的发生率高于动物胚胎发生。体外受精后获得的绝大多数早期人类胚胎表现出混乱的染色体嵌合体，并且通常存在数量和结构异常。即使在后期，即囊胚阶段，也只有 20-25% 的人类胚胎由具有正常核型的细胞组成。由于受精卵通常被培养至两个或四个囊胚阶段，然后再移植到子宫中，因此几乎不可能使用这样的胚胎来创建 ESC。直到最近，才开发出一种将受精卵培养至囊胚阶段的可靠技术。将该技术引入体外受精实践，不仅增加了成功植入的频率，而且使正常囊胚成为更容易获得的对象。

另一种多能干细胞来源是原始生殖细胞。与生殖上皮中更先进的祖细胞群不同，原始生殖细胞表面没有β-整合素，但表达高活性的碱性磷酸酶。值得注意的是，自20世纪80年代以来，人们就开始通过实验研究由原始生殖细胞形成的干细胞群。当时，一种从小鼠胚胎生殖腺的雏形中分离原始生殖细胞的技术被开发出来。体外培养原始生殖细胞的首次失败结果表明这些尝试是徒劳的，因为这些细胞虽然存活了下来，但却无法增殖并在第一天内死亡。后来证实，小鼠原始生殖细胞只有在培养基中存在可溶性和膜结合特异性多肽生长因子的情况下才能在体外繁殖。大量研究表明，为了原代生殖细胞的存活和增殖，培养基中不仅需要LIF，还需要膜结合型和可溶性的Steel因子（SIF）。这些肽是由Steel突变纯合的胚胎体细胞产生的，其中一种肽是cKit原癌基因的配体。

哺乳动物和人类的初级生殖细胞起源于性腺外，是生殖细胞系克隆发育的源头。原始生殖细胞系以及所有胚胎组织和胚外中胚层均起源于早期胚胎的外胚层（初级外胚层），该外胚层具有镶嵌结构。通过显微手术切除早期胚胎的各个部分，在外胚层中建立了原始生殖细胞定向前体细胞克隆的定位区。使用罗丹明葡聚糖作为细胞标记物，确定原始生殖细胞前体细胞位于外胚层的近端区域，靠近胚外中胚层。原始生殖细胞系起源于一个45细胞克隆，其分配发生在原肠胚形成之初。随后，克隆体分离，在原肠胚形成期，初级生殖细胞进入胚外中胚层，位于尿囊胚基部，原条带后方。从那里，初级生殖细胞向后肠内胚层的腹侧迁移，然后沿着肠系膜主动移动，在迁移结束时到达生殖嵴。在迁移过程中以及在生殖嵴内定位的最初2-3天内，初级生殖细胞活跃增殖，并经历8个复制周期。如果在迁移开始时大约有50个初级生殖细胞，那么在发育12天的小鼠胚胎的生殖嵴中，初级生殖细胞的数量将超过25,000个。

胚胎干细胞 (ESC) 与原始生殖细胞 (PGC) 的功能相似性体现在后者完全整合到囊胚中，内部细胞团被替换，随后胚胎发育成熟，其组织仅由原始生殖细胞的后代组成。在其他特性方面，小鼠PGC 也与 ESC 完全相同，表现出向多种方向分化的能力，可在体外形成胚状体，并在皮下注射到免疫缺陷小鼠体内后在体内形成畸胎瘤，类似于 129/ter 小鼠体内自发性睾丸畸胎瘤。

研究发现，当在培养基中添加LIF、膜结合型SIF和可溶性SIF时，分离的8日龄小鼠胚胎的原代生殖细胞能够在培养物中存活并繁殖4天，但随后死亡。此外，在培养物中观察到原代生殖细胞死亡的时期恰逢小鼠胚胎发育阶段（12.5-13.5天），此时雌性原代生殖细胞在性腺的雏形阶段进入减数分裂，而雄性原代生殖细胞的有丝分裂则受阻。然而，如果在培养基中不仅添加生长因子LIF和SIF，还添加FGF2，原代生殖细胞仍会继续增殖，并且在传代培养中形成即使在从培养基中去除生长因子（SIF和FGF）后仍能增殖的细胞集落。此类细胞无需添加可溶性生长因子LIF，即可在胚胎成纤维细胞基质上长期培养。有人提议将这些从原始生殖细胞中获得的稳定细胞系称为胚胎生殖细胞。这个术语完全不合适，因为在培养胚胎生殖细胞（EG）时，不可能获得能够进行后续卵子发生或精子发生阶段的胚胎生殖细胞。这是因为，尽管EG细胞系源自原始生殖细胞，但在培养过程中获得了胚胎多能干细胞的特性，却失去了分化成生殖谱系的能力。换句话说，原始生殖细胞在培养时会失去配子前体的特性，并转化为类似胚胎干细胞（ESC）的多能细胞。

已发现，将胚胎干细胞（EG）引入免疫缺陷小鼠体内不会形成畸胎瘤。据推测，人类胚胎干细胞（EG）丧失产生畸胎瘤的能力是由于这些细胞系并非直接由培养的原代生殖细胞产生，而是从胚状体分离的细胞中获得的。因此，它们可能是多能性但已定型的细胞的后代。

需要注意的是，EG细胞与原始生殖细胞之间存在根本区别。后者无法获得嵌合小鼠胚胎，这表明原始生殖细胞缺乏整合到内细胞团或滋养外胚层的能力。原始生殖细胞群的特征更类似于后期胚胎的体细胞定向系，将其引入囊胚也不会导致嵌合胚胎的形成。

通过改进胚状体（EG细胞聚集体）的培养技术，我们能够通过选择性培养基筛选获得另一群多能细胞，称为“胚状体衍生细胞”（EBD细胞）。EBD细胞能够在培养中长期增殖，这使得我们能够构建稳定的定型细胞系。我们获得了表达多种特化细胞mRNA和蛋白质标记的细胞克隆。这种方法最终证明了人类原代生殖细胞具有多能性，并且在体外能够分化成不同类型的细胞：神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞、造血细胞、肌肉细胞和内胚层细胞。

胚胎干细胞的替代来源

人类胚胎干细胞系的另一种来源可能是杂交细胞。将通过电穿孔技术将人类胎儿体细胞与预先去除原核的牛卵子融合而获得的异质构建体植入假孕母牛的子宫，可以从处于植入前发育阶段的人工胚胎中获得内部细胞团。为此，首先从移植了人类细胞核的牛卵子中获得囊胚。

在第二阶段，从囊胚中分离出胚母细胞，并使用Thomson方法从中分离ESC。值得注意的是，使用该方法分离ESC系的最佳结果是使用处于休眠状态的卵泡细胞或原代生殖细胞的细胞核获得的。这是因为移植到牛卵子中的人类细胞的细胞核必须具有未缩短的端粒和高端粒酶活性，这有助于避免从杂交卵子中获得的ESC克隆过早老化（Repin，2001）。已知ESC最重要的细胞内标记蛋白是Oct3、Oct4、Tcf和Groucho，它们属于所谓的染色质沉默蛋白。沉默子提供了特别紧密的异染色质包裹，从而阻止了真染色质环的形成。这些蛋白质介导的染色质包装与胚胎干细胞基因组的全能性相关。迄今为止，已证实成熟的牛卵母细胞和人类卵母细胞是唯一在细胞质中含有高浓度沉默蛋白的特化细胞。在此基础上，开发了一种通过将体细胞核移植到去核牛卵母细胞中来获取杂交胚胎干细胞的方法。初步体外研究表明，牛卵母细胞的细胞质在培养12-24小时后可恢复人类体细胞核基因组的全能性。

尤其令人感兴趣的是关于人类胚胎植入前发育特性的数据，这表明人类胚胎中全能细胞被多能细胞群取代的时间比小鼠晚。一项细胞转化研究表明，滋养层细胞除了胚胎干细胞外，也源自人类囊胚内细胞团的细胞，这表明它们具有完全潜能。

已知在囊胚阶段，会出现两种不同分化的细胞群。其中一种构成囊胚的外层——滋养外胚层，其衍生物包括滋养层细胞和胎盘的其他胚胎成分。第二种细胞群聚集成致密的团块，与滋养外胚层内表面接触。内细胞团细胞群的衍生物包括胚胎器官的所有组织和雏形。在晚期囊胚阶段，内细胞团形成了胚外内胚层，并形成了外胚层（初级外胚层）。在这种情况下，外胚层细胞保留多能性，而胚外内胚层细胞的分化能力有限。

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

获取人类胚胎干细胞

直到最近，人们还认为不可能从滋养层细胞中提取胚胎干细胞。然而，从囊胚中分离出的二倍体滋养外胚层干细胞系在含有FGF2和肝素（而非LIF）的培养基中增殖并转化为干细胞。如果从培养基中去除FGF2，滋养外胚层细胞将停止增殖，染色体开始内复制，滋养外胚层细胞成分逐渐转化为巨型滋养层细胞。LIF之所以不能刺激滋养外胚层细胞增殖，可能是因为FGF2触发了一种不同的信号传导机制：FGF2与血浆受体（FGFR2）结合，激活细胞质中的MAP激酶——ERK1和ERK2。因此，当囊胚细胞中的一条信号通路 (LIF - gpl30 - JAK 激酶 - STAT3) 被开启时，内细胞团细胞转化为多能性 ESC，而当第二种跨膜信号转导机制 (FGF2 - FGFR2 - MAP 激酶 ERK1/ERK2) 被激活时，囊胚中会形成滋养外胚层干细胞。反过来，信号通路的选择取决于 oct4 基因的活性。该基因属于 POU 结构域，位于 17 号常染色体的 t 基因座，在卵子发生过程中、卵裂期以及囊胚内细胞团细胞和初级生殖细胞中表达。oct4 基因的功能性作用是编码多能细胞出现、分化和去分化所必需的转录因子。

Oct4基因在胚胎干细胞（ESC）中的表达取决于该转录因子与辅因子的相互作用。oct4在囊胚中的表达定向调控表明，当其活性降低时，一半的细胞会形成滋养外胚层；而当oct4的诱导表达增加时，则主要形成ESC。

在实验中，在卵裂期、原肠胚形成期和胚胎发育的后期，在培养全能性胚泡时，ESC 无法转移至细胞系中。小鼠 ESC 通常在妊娠第 3.5-4.5 天分离，这相当于正常胚胎发生的第六阶段（单层囊胚）和第七阶段（双层囊胚 - 早期卵筒）。显然，只有在植入前期，小鼠胚胎才含有能够转化为 ESC 的细胞群。因此，只有在胚胎发生的某些阶段才有可能分离 ESC 系。从发育成具有胚膜和胎盘的可行胚胎的可能性来看，卵裂期产生的受精卵和胚泡是全能性的。生殖细胞总潜能的丧失始于桑葚胚后期，此时胚泡的进一步定向发育取决于它们的位置。早期桑葚胚胚泡保留了全能性，因为改变其定位的实验操作（例如其位置的反转）不会阻止成熟胚胎的发育。

已证实，胚胎干细胞分离成系的效率受胚泡植入时的状态影响。在妊娠第3.5天切除卵巢并给予孕酮的小鼠生殖道中模拟7天的休眠期后，使用胚泡可更成功地分离胚胎干细胞系。据推测，在这种条件下，形成内细胞团的胚泡数量会增加。细胞周期也可能延长，大多数胚泡进入G0期。

此外，稳定的多能性ESC系的建立取决于胚胎的基因型：从129小鼠系的囊胚中分离ESC相当容易，而使用CS7BL/6小鼠获取则要困难得多，而从CBA/Ca小鼠的囊胚中分离ESC系几乎是不可能的。显然，早期胚胎具有一些影响多能性ESC系发育的遗传特征。尽管如此，通过培养分离的外胚层以及选择性分化细胞，仍然可以从CBA/Ca小鼠的早期胚胎中分离出ESC系。

早期胚胎实验技术实验室手册中提供了从囊胚中获取ESC系的成熟标准技术。此外，还可以通过培养4.5日龄小鼠胚胎的分离外胚层（初级外胚层）来获取实验性ESC系，这需要使用一种相当复杂的显微外科技术并改进培养条件。该操作的劳动强度是合理的，因为在这种情况下，ESC系的形成频率明显高于囊胚内细胞团的实验。

为了分离 ESC 系，将每个克隆转移到微孔中，培养 40-60 个细胞，然后再次分散。重复此过程多次，我们便可获得永生化 ESC 系，该系具有附着在塑料上的正核型细胞的最大增殖率，并且在 50-100 次传代后仍保持全能性和高端粒酶活性。在维持 ESC 系的过程中，最大的危险是培养基或血清被细菌内毒素污染——即使培养基中微量内毒素也会导致未成熟生殖细胞大量死亡。通过仔细监测线性生长和及时分散，培养中的 ESC 能够对称分裂，其中两个子细胞都保持多能性并能够进行无限次的细胞周期，维持二倍体核型和总潜能。

将含有编码绿色荧光蛋白 (GFP) 合成基因的重组 DNA 分子转染到人类胚胎干细胞 (ESC) 基因组后，即可筛选出纯种胚胎干细胞 (ESC)。当胚胎干细胞在支持其增殖的条件下生长时，GFP 的表达会增加，而当其分化开始时，该基因的表达水平会降低，这使得我们能够在选择性培养基中筛选出纯种稳定的多能细胞系。使用 GFP 筛选分离的胚胎干细胞进行培养时，集落形成率会成倍增加，因为在筛选培养条件下，分化细胞强大的抗增殖作用会被消除。

将人类胚胎干细胞转化为细胞系，是通过从体外受精后剩余的植入前胚胎（约80-120个细胞）中分离干细胞的方法进行的。为此，将人工获得的“过剩”胚胎机械分散于Delbecco-Eagle培养基中。用带有荧光标记的选择性单克隆抗体标记细胞后，分离出胚泡细胞。使用分散酶-胶原酶混合物将胚泡细胞分散成单个细胞。分离的细胞在特殊培养基（80% Delbecco培养基 + 20% 胎牛血清，添加500 μg/ml IL-6、LIF和SCF）中，在前3代胚胎成纤维细胞的饲养层单层上生长。在这种情况下，由于IL-6、LIF和SCF的作用，干细胞和祖细胞得以存活和增殖。在这样的培养基中，胚胎干细胞以悬浮克隆的形式生长，这些克隆由未贴壁的球状细胞组成，必须通过轻柔的反复移液将其分离。新的克隆会在悬浮培养物中于第5-7天出现。胚胎干细胞的最大生长速度是通过在10-15个细胞阶段反复分离克隆来实现的。然后，将每个克隆转移到微孔板中，使其生长至40-50个细胞的聚集体。该过程在传代过程中重复多次，使培养体积增加到每6厘米培养皿500万-1000万个细胞的密度。通过这样的传代方法，Thomson分离出了10个永生化的人类胚胎干细胞克隆，这些克隆在传代100次后仍保留了高端粒酶活性、旺盛的增殖能力、最低限度的表型特征和总潜能，能够分化成350种源自外胚层、中胚层和内胚层的特化细胞系中的任何一种。人类胚胎干细胞（ESC）的分化始于（在更换培养基、添加血清和消除LIF后），此时细胞开始附着于基质，这表明细胞骨架已发育成熟，粘附受体也开始表达。重要的是，即使ESC能够无限增殖，其核型仍然保持正常。

分离人类胚胎干细胞系的第二种方法基于原代生殖细胞。实验研究表明，可以从12.5天龄小鼠胚胎的生殖褶中获得E细胞系。然而，在这些情况下，祖细胞系的形成频率明显低于使用更早胚胎的实验。同时，来自孕龄13.5天小鼠胚胎生殖腺的原代生殖细胞根本无法转化为细胞系。

首批稳定的多能性人类胚胎生殖细胞（EG）细胞系是从5-9周龄胚胎生殖腺中分离的原代生殖母细胞中获得的。分离的细胞在含有灭活小鼠胚胎成纤维细胞的DMEM培养基中培养，培养基中添加了胎血清、巯基乙醇、毛喉素和重组人生长因子（FGF和LIF）。培养7-12天后，培养物中出现多细胞集落，其形态特征和分子标记与人类EG细胞相符。这些细胞聚集后形成胚状体，并进一步发育成具有三个胚层衍生物特征的特化细胞。在10-20代传代过程中，EG细胞系保持了正常的核型，且未丧失多能性。

研究还表明，LIF、膜结合因子和可溶性Steel因子以及TGF-β的联合作用会改变原始生殖细胞的发育程序。原始生殖细胞不会停止有丝分裂并开始分化为卵子发生或精子发生，而是继续增殖。经过几个额外的有丝分裂周期后，它们变得类似于外胚层细胞，并失去生殖细胞前体的特性，转化为多能性胚胎干细胞（EG）。

因此，1998年，研究人员首次从人类胎儿尸检组织的生殖器雏形中分离出永生化的原始生殖细胞系。在人类胚胎发生过程中，原始生殖细胞在发育第3周出现在卵黄囊中，并在第4-5周迁移至生殖结节区，并在那里形成休眠的初级生殖母细胞群。处于非活性状态的原始生殖细胞在胚胎中保存直至出生。原始生殖细胞系是从5-9周胚胎的胎儿生殖结节中分离出来的，提取的组织用IV-V型胶原酶、透明质酸酶和DNA酶的混合物进行临时处理，以提高细胞的数量和质量。胎儿生殖结节组织中的原始生殖细胞被基质（间充质）塞托利细胞包围。塞托利细胞的功能性作用是产生抗凋亡因子（Fas配体）、丝裂原和免疫抑制剂，保护生殖细胞免受机体的免疫攻击。此外，生殖结节的基质微环境在配子的成熟过程中起着重要作用。分离的原代生殖细胞被接种到由前三代胎儿成纤维细胞组成的饲养基质层上进行培养。最有效的丝裂原组合是由LIF、FGF和毛喉素（一种cAMP形成的刺激剂）组成的复合物。原代生殖细胞体外增殖需要添加胎儿血清，在胎儿血清存在下，培养的原代生殖母细胞的繁殖伴随着不附着于基质的球形细胞克隆的形成。

美国国立卫生研究院（NIH）基于对现有囊胚分离人类胚胎干细胞系方法数据的总结，初步得出结论：在内细胞团发育良好的囊胚中，成功分离胚胎干细胞的可能性最高（《干细胞：科学进展与未来研究方向》，美国国立卫生研究院）。由此看来，用于构建胚胎干细胞系的最佳胚胎干细胞来源是发育第5天的囊胚，分离内细胞团时应小心去除滋养外胚层。分离出的内细胞团在此阶段由30-35个细胞组成，应在小鼠胚胎成纤维细胞基质上进行培养，这是培养过程中形成胚胎干细胞集落的决定性条件。

胚胎干细胞表型特征分析

尤其令人感兴趣的是跨物种比较分析胚胎干细胞（ESC）的表型特征。研究发现，人类ESC集落是由扁平的上皮样细胞组成的致密簇状结构，而小鼠胚胎拟体则由松散的圆形细胞团块组成。人类ESC的核浆比指数低于小鼠ESC。猴类胚胎干细胞形成更扁平的细胞集落，边缘不均匀。在灵长类动物ESC的早期克隆中，单个细胞清晰可见。所有研究动物物种的增殖ESC均不表达MHC I类和II类分子。同时，人类ESC对TERA 1-60和GCTM-2抗体呈阳性反应，这表明其表面存在角蛋白/硫酸软骨素蛋白聚糖，这是胚胎（畸胎）癌干细胞的特征。 oct4基因在所有动物物种的ESC中均有表达，这表明，尽管表型存在差异，但负责维持多能性的同一组基因在人类和小鼠的ESC中显然被激活(Peru, 2001)。此外，从大鼠、猪、兔、灵长类动物和牛胚胎中分离的ESC系具有相似的形态特征、相似的分子识别标记以及几乎相同的实施胚胎发生程序的分子机制，这使我们能够重新审视异种移植问题。

与体内正常的胚胎发生不同，ESC 的体外增殖不伴随胚层的形成，而是在同源异型 Hox 基因受阻的背景下发生的，即没有器官发生。由于分割基因不起作用，在 ESC 培养中不可能重现胚胎发生的这些时期，例如体节的产卵、胚胎分割、卵黄囊、尿囊和其他临时器官和组织的形成。培养的 ESC 似乎在 350 个特化细胞限制系形成过程的开始就冻结了。因此，子代祖细胞的克隆和位于中心的 ESC 仅代表胚胎的一种模型，在胚胎发育过程中，不同的组织区域同时形成不同的特化细胞系，但这些细胞系源自共同的前体。尽管胚胎干细胞表面受体水平极低，但它们仍保留着进行原始形态发生过程的能力，能够模拟早期胚胎的体积结构：培养的胚胎干细胞悬浮液会聚集并形成类似囊胚甚至后期胚胎（卵柱）的结构。这种悬浮聚集体分别被称为简单拟胚体和复杂拟胚体。

在混合分化中，外胚层（oct3、fgf-5、nodal）、内胚层（gata-4）、中胚层（brachyury）、心脏中胚层（pkh-2.5）、神经管（msx3）和造血（elkf）的早期基因同时在一个胚状体的不同细胞中表达。通过利用各种生长因子和细胞因子组合，在体外靶向作用于胚层细胞的形成，在许多情况下可以获得外胚层或中胚层基因优先表达的胚状体，这为模拟原肠胚形成和器官发生的初始阶段开辟了道路。

胚胎干细胞（ESC）的克隆生长是细胞不对称分裂的证据，其中克隆中心只有一个ESC保留无限的增殖潜力，而第二个子细胞则产生一代已处于分化阶段的祖细胞。因此，胚状体边缘的克隆增殖率高于中心。生长中的克隆的边缘细胞会经历自发的无序分化、迁移或因凋亡机制而死亡。这些事件决定了克隆的命运：如果增殖率超过迁移率和凋亡细胞死亡率，则克隆会继续增大；当凋亡率和新细胞形成率相等时，克隆会趋于稳定；当这些过程的比例相反时，克隆会退化。祖细胞对称分裂，即两个子细胞随后都会分化成成熟的特化细胞系。ESC与祖细胞的比例各不相同，但ESC的数量始终只占祖细胞总数的一小部分。因此，只有小心移液并及时解离克隆才能增加培养物中的胚胎干细胞数量。事实证明，在10-12个细胞阶段解离克隆是获得最大胚胎干细胞产量的最有效方法。胚状体中细胞的分化方向和程度取决于其位置。胚状体的外层细胞不表达oct4基因，并分化为初级内胚层细胞，随后由这些细胞形成壁层和内脏胚外内胚层的上皮样细胞。胚状体的内层细胞表达oct4基因，并在培养48小时内保持多能性。然而，培养物随后在形态上重塑为上皮单层，并开始表达控制初级外胚层发育的基因。接下来，完全无序的细胞分化过程开始，出现各种源自所有三个胚层的细胞类型。在胚状体细胞自发分化的过程中，首先出现的是卵黄囊碎片（囊肿）形式的带有内胚层标记的聚集体。随后，血管母细胞和正在生长的毛细血管的内皮细胞出现在这些结构中。在自发分化的最后阶段，各种终末分化细胞从胚状体的内部细胞发育而来，包括神经元、神经胶质细胞、心肌细胞、巨噬细胞和红细胞。在一定程度上（考虑到生殖组织层形成的空间反转），利用胚状体可以研究体外形态发生过程，并分析胚胎细胞分化初期的分子机制。以及确定特定基因在执行这些过程中所起的作用。

因此，在克隆中，存在着被发现具有不同遗传发育程序的细胞——胚胎干细胞、早期祖细胞和分化祖细胞群。通过悬滴培养或大量培养方法（不使用饲养层且不在培养基中添加LIF）培养胚胎干细胞不可避免地会导致胚状体的形成。胚状体外层和内层的细胞形态不同。外层由大的、分枝状的细胞组成。它们面向环境的表面覆盖着大量的微绒毛。细胞外层与内层由一层类似赖歇特膜的基底膜隔开，而胚状体内层的细胞为柱状上皮。从形态上看，内层虽然含有许多分裂细胞，但更类似于未分化的胚胎干细胞集落。

人类胚胎干细胞的特征

在同源基因阻断的背景下，实质-间质信号相互作用的缺失会导致培养的胚胎干细胞（ESC）生长紊乱，因为这会扰乱临时器官基础结构的形成和发育。培养的胚胎干细胞生长紊乱和自发分化紊乱是由于未来器官基质框架缺乏间质标记：体外培养可能形成数百万个肝细胞，但不可能获得包含窦、迪氏腔和库普弗细胞等结构和功能要素的单个肝小叶。

人们认为，胚胎干细胞的多能性仅在胚胎发生过程中实现，即胚胎组织和器官的形成，而胎盘和脐带则是滋养层细胞的衍生物。包裹在滋养外胚层膜内的胚胎干细胞会依次产生临时细胞的克隆，这些细胞通过诺赫捷耶夫体积拓扑矩阵的组合mRNA执行发育程序，这些mRNA预先决定了临时器官和最终器官的空间排列、形状和大小、细胞数量，以及实质细胞如何组装成结构和功能单元。同时，胚胎干细胞仍然是唯一一种其潜能实现分子机制与遗传发育程序完全脱节的细胞类型，并且由于受体感知和信号转导系统均被阻断，胚胎干细胞本身丧失了与其他细胞相互作用的能力。然而，胚胎干细胞的充分激活会逐步促进胚胎发生程序的发育，最终形成一个由数十亿个细胞组成的成熟生物体，为宫外生存做好准备。在细胞空间中这条短暂却难以想象的漫长路径上，确保细胞生命活动的分子机制以及控制细胞增殖、分化和特化的程序都不可避免地会出现错误。因此，在现代药物基因组学中，分子结构疾病和细胞程序疾病被分开研究。此外，大多数新药的作用旨在纠正分化、增殖和器官发生程序，以及器官和组织的再生。在成年生物体中，胚胎干细胞可以控制移植到大脑、肝脏、脾脏、骨髓和其他人体器官中的干细胞/祖细胞的行为，通过在保存的间充质基质上分化和特化供体细胞来修复受体器官受损的实质。本质上，全能性程序始于卵母细胞、受精卵和胚泡基因组层面；然而，这些细胞尚未被克隆和传代，数量之多远不足以满足实验和实际医学的需求。因此，胚胎干细胞仍然是遗传信息的独特来源，它包含着构建胚胎三维图谱的密码，以及在原肠胚形成过程中对特化细胞系进行线性限制的密码。

胚胎干细胞（ESC）几乎无限的再生潜力源于其基因组与分化体细胞的遗传结构不同，它保留了多能性。ESC中嵌入的遗传信息处于休眠状态的表现之一是所谓的最小表型——ESC表面仅表达有限数量的受体，因此，在细胞核结构与其微环境相互作用的过程中，只有极少的跨信号程序被激活。在负责限制特化细胞系和细胞分化的基因处于休眠状态的背景下，500个基因中只有大约30个被激活，而这些基因的产物确保了细胞与周围微环境的连接。利用基因表达系列分析方法，结果表明，在体细胞和胚胎干细胞（ESC）中，在基因组中调控能量和代谢的主要功能盒共同作用下，ESC中受体、G蛋白、次级信使、转录酶、表达和抑制辅因子（即向细胞传递调控信号的整个跨膜系统）的mRNA水平非常低。这是由于信号传导基因的缺失或表达水平非常低造成的。在ESC基因组诱导分化期间，18个功能基因同步停止工作，而61个信号传导基因被激活，这些基因控制着细胞粘附受体、细胞外基质成分、限制性转录酶以及信号从细胞质膜受体向细胞核传递的信使元件的合成。同时，负责合成沉默蛋白的基因表达以及确保ESC基因组全能性的基因表达共抑制剂的表达受到阻断。

已发现所有三个胚层细胞的基因标记。外胚层细胞层的识别是通过nodal、oct3和fgf-5基因的表达进行的，中胚层细胞的识别是通过brachyury和zeta-globin基因的表达进行的，内胚层细胞的识别是通过gata-4基因的表达进行的。在正常的胚胎发生过程中，在原肠胚形成期，可以观察到未成熟的干细胞和祖细胞群的主动迁移，局部标记着颅骨面骨、部分脑区、周围神经系统、心脏传导系统和胸腺的发育区域，这些区域的组织是由迁移细胞的克隆形成的。通过胚层早期基因对细胞进行标记，有助于对发育胚胎中前体细胞迁移过程进行拓扑分析。具体而言，已证实在P19胚胎癌细胞聚集体中，第一个中胚层基因brachyury的表达开始于组织纤溶酶原激活剂、甲胎蛋白、角蛋白8和角蛋白19基因表达下降的时期，而这些基因是第一个迁移的中胚层群体的标志。因此，中胚层起源的组织的形成仅在中胚层祖细胞的点迁移和扩散过程完成后才开始。

尽管表型特征极其有限且缺乏大多数跨信号传导单元，ESC 仍能表达一些可用于识别的受体分子。值得注意的是，人类和灵长类动物的 ESC 标记抗原已被证实很常见。通常，ESC 标记抗体用于膜结合抗原 SSEA-3、SSEA-4（独特的脂质抗原，代表糖脂 GL7 与唾液酸的复合物）以及高聚物糖蛋白 TRA-1-81、TRA-1-60。此外，ESC 表达特异性胚胎抗原 SSEA-1 和内源性碱性磷酸酶，以及特异性转录因子 Oct4。后者是维持 ESC 增殖机制所必需的——特异性转录因子 Oct4 可激活成纤维细胞生长因子 4 基因的表达，并稳定负责未成熟细胞中 DNA 无限复制的基因盒的表达。最重要的细胞内标记蛋白是Oct3、Oct4、Tcf和Groucho，它们与染色质沉默蛋白有关。

多年来，体外培养胚胎干细胞（ESC）的尝试几乎立即取得成功，并获得了首批从小鼠囊胚中分离的干细胞培养物和原代生殖细胞培养物。随后，研究人员开始研究将ESC引入发育早期的胚胎，以探究其多能性。结果表明，在桑葚胚和囊胚阶段，ESC能够形成嵌合胚胎，在这些嵌合胚胎中，供体ESC的后代可以在所有体细胞组织甚至配子中检测到。因此，在发育生物学中，ESC在体内和体外实验研究之间架起了一座“桥梁”，极大地拓展了研究原代组织和器官的形成、分化以及胚胎器官发生过程的可能性。

已明确证实，在体内胚胎发生过程中，ESC 会整合到早期胚胎的细胞团中，其衍生物则存在于所有器官和组织中。ESC 在嵌合胚胎中定植于一系生殖细胞中，其后代最终发育成成熟的卵子和精子。胚胎干细胞具有克隆形成能力——单个 ESC 能够形成一个基因完全相同的细胞群，该群落具有分子标记，包括 oct4 基因和碱性磷酸酶的表达、高端粒酶活性以及某些胚胎抗原的表达。

为了研究胚胎干细胞（ESC）的胚胎发生机制，已开发出一种桑葚胚嵌合方法，该方法通过构建一个生物结构，在其外部包裹一层受体四倍体胚泡，并将供体ESC引入其内部。这样，滋养层由受体四倍体胚泡的后代形成，从而确保着床和胎盘形成；供体ESC则充当内部细胞团，从中形成可存活胚胎的主体和一系列初级祖生殖细胞。ESC的研究价值不仅在于其基因组体外操作过程中能够保留多能性，还在于其参与嵌合胚胎初级生殖细胞形成的能力。研究表明，仅一个经过基因改造的ESC的后代就能填充嵌合胚胎的所有初级形态和发育组织，而嵌合胚胎是通过将其与一个8细胞胚胎聚集或共培养而获得的。将转染了绿色荧光蛋白基因的胚胎干细胞（ESC）移植到小鼠桑葚胚中，在发育胚胎的所有研究组织中都发现了该细胞的荧光后代（Shimada，1999）。将ESC移植到桑葚胚中可以培育出完全由供体ESC后代组成的可存活小鼠，这为各种治疗性克隆开辟了前景。这种方法学目前已成功用于研究发育生物学问题，特别是用于分析X染色体遗传失活或ESC表观遗传不稳定性机制。将ESC移植到早期胚胎中也用于农业生物技术以及基因治疗实验。

基因改造胚胎干细胞（ESC）的移植可用于检测突变基因的靶细胞。体外培养的ESC在生物技术中用于构建基因敲除小鼠。为此，研究人员通过同源重组（敲除）从ESC中去除待研究的基因，并在选择性培养基中分离缺失该基因的细胞。然后将敲除的ESC植入囊胚或与桑葚胚胚泡聚集。将以此方式获得的嵌合早期胚胎移植到受体雌性小鼠体内，并从新生小鼠中筛选出特定基因配子无效的小鼠。该技术已用于构建多种基因敲除小鼠品系，广泛应用于实验生物学和实验医学。此类生物模型用于研究某些基因在胚胎发育中的重要性，以及它们在人类疾病和病理状态机制中的作用。此外，基因敲除动物品系还用于新型基因治疗方法的临床前测试。例如，通过将突变基因的正常等位基因转染到 ESC 基因组中，可以有效地纠正影响造血系统的突变。将外来基因引入 ESC 可以快速创建纯合转基因实验动物系。然而，值得注意的是，迄今为止，靶向重组基因缺失技术仅在小鼠 ESC 方面得到可靠发展。使用双敲除小鼠 ESC，确定了 7 号染色体上基因簇区域（人类 19 号染色体基因组区域的副本）和 11 号染色体近端区域（人类 5g 染色体的副本）的功能性作用 - 在小鼠 ESC 中删除这些基因使得评估其类似物在人类中的功能成为可能。

研究人类胚胎发生基因功能的可能性已经扩大，将其转染到实验动物胚胎干细胞基因组中，尤其可以阐明隐窝基因在心脏中胚层形成和发育中的作用，以及pax-6基因在眼部胚胎发生中的作用。目前正在绘制小鼠畸胎瘤和囊胚未成熟增殖期胚胎干细胞中基因表达的首张图谱，并已证实胚胎干细胞中信号传导基因的抑制作用。将60-80个突变胚胎干细胞与20-30个正常植入前小鼠胚胎细胞组合，可形成嵌合胚胎，其中器官原基由供体细胞和受体细胞组成，这使得阐明未知基因在原肠胚形成和器官发生中的作用成为可能。正在发育的小鼠胚胎基因功能图谱补充了有关 sf-1 基因在肾上腺和性腺形成中的作用、wt-1 基因在肾脏形成中的作用、myoD 家族基因在骨骼肌形成中的作用以及 gata-1-4 家族基因在红细胞生成和淋巴细胞生成雏形的限制成熟中的作用的信息。

利用载体重组酶定向关闭胚胎干细胞（ESC）中的父系和母系等位基因，可以阐明各种基因在胚胎发生早期的功能，而将未知的人类基因定向转移到小鼠ESC的技术有助于发现导致严重遗传性病变发展的新突变基因。通过敲除方法，确定了一些基因对于胚胎组织形成的必需意义：gata-4 - 负责心肌；gata-1 - 负责造血组织的红系；myoD - 负责骨骼肌；brachyury - 负责中胚层；限制性转录酶hnf3和hnf4 - 负责肝脏干细胞；rag-2 - 负责T细胞和B淋巴细胞克隆的形成（Repin，2001）。 ESC 中基因的双重缺失为研究胚层基因的功能作用、分节和同源异型打开了大门，而 ESC 移植则使获得可存活的跨物种杂交胚胎成为可能。使用改进的技术将单个供体 ESC 移植到 8 细胞胚胎中，已经证明了受体胚胎的许多器官在细胞水平上发生了嵌合。值得注意的是，在将人类造血干细胞引入胚泡后，在受体小鼠的器官中发现了人体组织的细胞芽。已经确定多能 ESC 在小鼠胚胎的器官形成期间在血液中循环。它们的生物学功能可能在于未来免疫系统的胚胎组织中。借助胚胎干细胞（ESC），已在实验室条件下复制了人类遗传病理学的适当模型：抗肌萎缩蛋白基因双敲除模型可导致小鼠杜氏肌营养不良症；atm基因（控制染色质信号激酶合成）关闭模型可导致共济失调-毛细血管扩张症。这种致命的儿童遗传性疾病是由于DNA修复缺陷导致小脑浦肯野细胞退化，并伴有增殖细胞死亡导致胸腺退化。通过将病理遗传信息导入ESC，在嵌合体小鼠中复制的共济失调-毛细血管扩张症的临床表现、病理生理学和病理形态学与人类的一致。除了共济失调毛细血管扩张症之外，利用ESC和基因敲除小鼠，还开发了一些与碳水化合物和脂质代谢、氨基酸分解代谢以及铜和胆红素排泄病理相关的遗传性纯合人类疾病的实验模型，这大大扩展了实验医学在治疗相应人类疾病的新方法的临床前测试阶段的能力。

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

干细胞杂交体的使用

将胚胎干细胞与体细胞融合获得的杂交细胞是研究干细胞多能性和分化细胞染色体重编程的理想模型，且前景广阔。将胚胎干细胞与成年动物分化细胞融合获得的细胞杂交细胞，可以研究不同“年龄”基因组之间的关系：当来自不同分化阶段和不同成熟度细胞的同源染色体位于同一细胞核中时，就会出现一种独特的情况，它们可以轻松地交换反式调控信号。很难预测在个体发育过程中形成的同源染色体顺式调控表观遗传系统将如何应对来自胚胎相关基因组的反式信号的影响。此外，亲本染色体的分离发生在杂交细胞中，这使得我们可以在单个染色体的水平上研究基因组的相互作用，也就是说，可以潜在地确定特定染色体在维持多能性或相反地退出分化过程中的参与情况。

将多能性畸胎瘤细胞与分化的体细胞融合而产生的细胞杂交细胞，被用作研究不同“发育史”基因组之间相互作用的首个实验模型。在某些情况下，此类杂交细胞保留了相当高水平的多能性。具体而言，畸胎瘤-体细胞杂交细胞在体内诱导形成了含有所有三个胚层衍生物的真性畸胎瘤，而在体外悬浮培养中，它们形成了胚状体。即使在这种类型的种间细胞杂交细胞中，当与畸胎瘤细胞融合的体细胞伴侣是淋巴细胞或胸腺细胞时，也会观察到胚胎抗原的存在。值得注意的是，将畸胎瘤细胞与成纤维细胞融合而产生的细胞杂交细胞在表型上与成纤维细胞相对应。

最重要的既定事实是，在畸胎瘤-体细胞杂交细胞中，分化细胞基因组出现了重编程的迹象，其特征是单个基因或体细胞伴侣失活的X染色体被重新激活。因此，对畸胎瘤-体细胞类型的细胞杂交细胞的研究结果表明，杂交细胞中多能性通常得以保留，并且存在体细胞伴侣基因组重编程的迹象。

在小鼠胚胎干细胞与成年脾细胞融合获取种内胚胎杂交细胞的实验中，研究了此类细胞杂交细胞的特征，分析了亲本染色体的分离情况，并评估了杂交基因组的多能性。畸胎瘤细胞与体细胞融合获得的种内杂交细胞通常染色体分离程度较低，核型为四倍体或近四倍体。在原代生殖细胞与淋巴细胞融合获得的细胞杂交细胞中也观察到了类似的染色体组成。同时，小鼠畸胎瘤细胞与水貂淋巴细胞融合获得的种间杂交细胞中，体细胞伴侣的染色体分离程度较高。

随着利用聚合酶链式反应分析微卫星的方法的开发，种内杂交亲本染色体分离研究进入了一个全新的阶段，通过该方法，我们可以为每个小鼠染色体发现数百个标记，从而可以可靠地区分杂交细胞中任何一对同源染色体。

通过将 ESC（缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶活性的 HM-1 细胞，2n = 40，XY，从 129/01a 小鼠的囊胚中分离）与同类系 DD/c 小鼠的脾细胞融合，可以获得一组形态类似于 ESC 的杂交克隆。所有克隆均在选择性培养基中分离，其中只有具有活性次黄嘌呤磷酸核糖转移酶的细胞才能生长。电泳分析显示，所有克隆都具有 DD/c 小鼠特征性的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶等位基因变体。细胞遗传学分析表明，四个杂交克隆中有三个具有近二倍体的染色体组。一个近四倍体克隆包含两个杂交细胞群，其中一个是四倍体，另一个较小的群体是二倍体。

微卫星分析可以区分小鼠 129/01a 和 DD/c 的任意一对同源染色体，在具有近二倍体的杂交克隆中，分析表明两个克隆中体细胞伴侣的常染色体明显优先消除。克隆 HESS2 和 HESS3 中的大多数常染色体都带有 129/01a 系（即多能性伴侣）的标记。1 号和 1 号染色体是个例外：在克隆 HESS2 和 HESS3 中，除了 HM-1 细胞的标记外，体细胞伴侣的标记也少量存在。这些结果可能反映了体细胞伴侣 1 号和 1 号染色体分离不完全，并且与细胞遗传学数据一致，即在克隆 HESS2 和 HESS3 的 30%-40% 的细胞中观察到这些染色体的三体性。克隆HESS4的染色体组成存在显著差异：该克隆中的许多常染色体源自ESC基因组（2、3、4、5、6、7、10、13、14和17号染色体），但1、9、11、12、15、16、18和19号染色体则由双亲的同源物组成。标记这些同源染色体的微卫星数量比例约为1:1。这使得作者推测一个同源物源自ESC基因组，另一个来自分化细胞。在克隆HESS4的某些亚克隆中，仅存在体细胞伴侣18和19号染色体的标记。所得结果表明，在HESS4克隆的细胞中，除了体细胞伴侣的染色体分离之外，还发生了多能基因组中上述染色体的一个或两个同源物的消除，也就是说，父母双方的染色体都发生了双侧分离 - 这是一种非常不寻常的现象，因为仅父母一方的染色体分离是细胞杂交的特征。

此外，在第20代之后，所有杂交细胞克隆都仅含有体细胞伴侣X染色体的标记，即克隆中的ESC X染色体被体细胞伴侣的X染色体所取代。使用针对小鼠X染色体的FITC标记探针进行的原位杂交数据证实了这一重要事实：仅在一条染色体上检测到了阳性信号。值得注意的是，根据细胞遗传学数据，在培养的早期阶段（第15代之前），许多细胞含有两条X染色体。因此，使用选择性培养基可以操纵杂交细胞的染色体组成，并在ESC基因组的背景下选择性地选择携带体细胞伴侣单条染色体的克隆。

由于细胞杂交基因组的独特之处在于亲本基因组位于一个细胞核内，因此，在胚胎干细胞-体细胞杂交中，当胚胎基因组与分化细胞的基因组紧密接触时，其多能性如何得以保留，这自然而然地引发了一个问题。从形态学上讲，ESC和体细胞的细胞杂交与亲本ESC系相似。多能性评估表明，所有具有近二倍体染色体组的克隆都能在悬浮培养中形成拟胚体，其中存在三个胚层的衍生物。

大多数杂交细胞都含有ECMA-7抗原（这是小鼠早期胚胎的特征性标记），并且具有较高的碱性磷酸酶活性。关于杂交细胞高多能性的最有力数据，是在一系列注射嵌合体实验中获得的，这些实验涉及HESS2克隆的杂交细胞。生化标志物分析表明，供体杂交细胞的后代存在于嵌合体的大部分组织中。因此，通过ESC与体细胞分化细胞融合获得的杂交细胞保留了较高的多能性，包括在注射到囊胚腔中时形成嵌合体的能力。

克隆HESS2和HESS4在亲本染色体组成上存在显著差异，但其多能性相似。可以假设杂交基因组中的多能性表现为显性特征，但胚胎基因组中并非所有染色体都参与维持多能性的过程。如果这一假设成立，那么可以预期，从杂交细胞基因组中移除多能性伴侣的部分染色体，并不会导致其多能性状态发生改变。在这种情况下，分析胚胎杂交细胞中亲本染色体的分离情况，将使我们能够更深入地识别控制胚胎细胞多能性的染色体。

O. Serov 等人 (2001) 将嵌合体与具有 129/01a 小鼠基因型并携带 DD 小鼠 X 染色体的正常小鼠杂交，获得了 50 只后代，但未发现任何后代。作者认为，这是由于杂交细胞在体细胞基因组的影响下多能性下降所致。另一种解释可能是，三体性对某些常染色体的负面影响以及杂交细胞在减数分裂过程中的性染色体失衡（在 15 代之前的细胞中都观察到了 XXY）。已知 XXY 细胞无法进行减数分裂并形成配子。三体性还会导致杂交细胞增殖活性降低，因此，嵌合体发育的选择优势可能属于受体胚胎的细胞。因此，为了充分评估杂交细胞的多能潜能，有必要获得具有正常二倍体染色体组的杂交克隆。

O. Serov 及其合著者（2001）的实验首次证明了在杂交细胞基因组中对体细胞X染色体进行重编程的可能性。作者的这一结论源于对嵌合体中hprt基因（X染色体标记）表达的分析：在所有分析的嵌合体组织中均检测到了DD/c小鼠hprt等位基因变体的存在。需要强调的是，在将杂交细胞引入囊胚腔后，细胞杂交体处于非选择性状态，而X染色体在杂交细胞基因组中的保留意味着它已成为其必需组成部分，基因组无法将其与多能性伴侣的Y染色体区分开来。

总结杂交胚胎细胞中体细胞基因组和多能性基因组相互作用的分析结果，作者得出结论：在某些细胞杂交种中，多能性表现为显性特征。杂交基因组能够对分化细胞的单个染色体进行重编程，但这并不能排除体细胞基因组对胚胎基因组多能性产生反向影响的可能性。在杂交细胞培养中，分化诱导发生的频率显著高于原始亲本系ESC HM-1。在原代集落形成过程中也观察到了类似的效应：许多胚胎杂交细胞的原代集落于形成早期就已分化，并在其选择和繁殖过程中大量丢失克隆。

因此，由胚胎干细胞与体细胞融合产生的细胞杂交细胞，尽管与分化细胞的基因组紧密接触，仍保留了胚胎基因组独有的多能性。此外，在此类杂交细胞中，源自分化细胞的单个染色体可以进行重编程。目前尚不清楚胚胎基因组的多能性在杂交细胞中保留的程度，尤其是它们参与嵌合体生殖系形成的能力。这需要获得具有正常核型的胚胎杂交细胞。无论如何，多能性胚胎杂交细胞可以成为识别参与维持或控制多能性的染色体的真正遗传模型，因为亲本染色体的双侧分离可能提供了这样的机会。

对O. Serov等人（2001）定义为“染色体记忆”的现象的研究同样引人注目。在杂交基因组中，同源染色体有两种不同的构型：体细胞伴侣的同源物曾经经历过分化，而多能性伴侣的同源物中，分化过程才刚刚开始。因此，杂交细胞保留了高多能性表明，尽管受到来自体细胞伴侣的转录因子的影响，ESC同源物的“多能性”构型在杂交基因组中仍然足够稳定。上述嵌合体发育过程中分化基因组同源染色体重编程的迹象并不排除这样一种可能性：在细胞杂交体体外形成和培养的初始阶段，它们保留了在体内分化过程中获得的状态。根据最近的数据，当胚胎杂交细胞被转移到非选择性环境中时，它们会表现出仅体细胞伴侣染色体的强烈消除，也就是说，杂交细胞的基因组在体外培养10-15代后就能轻易区分同源物。因此，胚胎杂交细胞不仅是一个很有前景的实验模型，可用于研究胚胎基因组的基本特性——多能性，还可用于研究其替代特性——胚胎分化。

胚胎干细胞移植的治疗效果

在分析胚胎干细胞及其衍生物移植的疗效之前，我们先对以上内容进行总结。胚胎干细胞在体外完全实现胚胎发生的能力尚不足，因为在这种情况下，发育缺陷是由于缺乏间充质干细胞造成的，而间充质干细胞在体内独立地、不依赖于胚胎干细胞而产生。胚胎干细胞的遗传潜能低于受精卵的遗传潜能，因此不能直接用于克隆胚胎。胚胎干细胞作为唯一能够完整、一致地执行发育程序的细胞，其独特的生物学潜能被用于基因功能研究。借助胚胎干细胞，可以解码激活编码三个胚层发育的早期和晚期基因表达的首批信号组合。胚胎干细胞基因组在体外保持多能性，使其成为修复性再生的独特工具，能够在器官和组织受损时自动补充细胞损失。在理想的假设情景中，可以认为“...在移植供体 ESC 时，紧密包装的程序被转移到接受者的体内，在有利条件下，这些程序在构建新组织时实现”，能够“...在形态和功能层面有效地融入接受者的体内”。

自然而然地，随着胚胎干细胞单分化方法的发展，对从一个特化克隆体外获得的细胞的功能活性的体内研究也随之展开。增殖的胚胎干细胞克隆能够产生具有迁移能力的祖细胞群，这些祖细胞能够真正主动整合到受体组织损伤区域，从而应用于再生医学。已证实，将多巴胺神经元移植到黑质可减轻实验性偏侧帕金森病的临床症状。供体神经干细胞的区域移植可减轻脊髓和脑外伤或挫伤引起的运动障碍程度。干细胞移植在脱髓鞘疾病中的首次积极成果也已获得。胚胎干细胞的再生医学潜力似乎为细胞移植在实际医学中的应用开辟了无限的可能性。然而，当移植到异位区域时，胚胎干细胞不可避免地会转化为肿瘤。将胚胎干细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠体内会形成畸胎瘤。当ESC悬浮液被移植到同基因小鼠的睾丸囊下时，也会形成畸胎瘤。畸胎瘤由不同的组织组成，其细胞来自所有三个胚层。在此类畸胎瘤中，器官发生减少的情况极为罕见。

大量研究证实，将早期胚胎干细胞（ESC）衍生物移植到患有实验性病理的动物身上取得了积极的效果。利用ESC衍生物进行细胞神经移植正在实验和首批临床试验中得到进一步发展，旨在纠正脑损伤和脊髓损伤的功能障碍，以及治疗脊髓空洞症和多发性硬化症（Repin，2001）。随着ESC体外神经发生技术的出现，人们正在开发一种新的方法，用于移植从胚胎神经组织培养物中获得的神经球衍生物，而不是使用胚胎脑组织。这种移植悬浮液的均质性显著提高，并含有定向的神经元和神经胶质细胞前体细胞。

在培养基中定期添加浓度为 10 μg/ml 的视黄酸，持续 6 周，在人胚胎（畸胎）癌系 NTERA-2 中可形成 80% 以上的有丝分裂后神经元。通过对免疫表型标记的成熟神经元进行流式分选，可去除畸胎癌和未成熟细胞的残留，从而实现神经元群的完全同质化。将这些神经元移植到实验动物的大脑不同区域后，它们不仅能存活，还能整合到区域神经网络中。对于具有局部中枢神经系统缺陷实验模型的动物，神经移植可减轻脑外伤、中风、脱髓鞘疾病、小脑发育的遗传性缺陷、脂质和多糖沉积疾病等人类疾病的临床表现。

为了优化中枢神经系统退行性疾病的再生过程，目前正在开发从胚胎干细胞（ESC）中获取髓鞘生成少突胶质细胞的技术。第一阶段通常包括ESC的增殖，以达到移植所需的细胞数量。第二阶段，在选择性标记抗原的控制下，将ESC定向分化为髓鞘生成少突胶质细胞前体细胞群。

利用胚胎干细胞（ESC）衍生物开发用于治疗胸腺成熟基因缺陷所致免疫缺陷的方法，前景广阔。在对基因敲除（rag 1）小鼠的研究中，这些小鼠存在诱导性基因缺陷——TCR基因V(D)J位点重组机制被破坏，导致T淋巴细胞功能丧失。将早期胚胎干细胞衍生物移植到动物胸腺中，可以恢复负责细胞免疫的正常免疫克隆群的成熟。目前，体外预制胚胎干细胞移植用于治疗儿童致死性遗传性贫血的临床试验正在进行中。

反对将干细胞移植快速引入临床的原因是，稳定的人类胚胎干细胞系数量有限，且需要对其进行标准化。为了提高标准化胚胎干细胞系以及成人干细胞的纯度，建议使用基于短串联DNA重复序列分子遗传学分析的细胞系筛选方法。此外，还需要检测胚胎干细胞系中是否存在微小的染色体重排和基因突变，这些突变在细胞培养条件下发生的可能性相当高。本文提出了对所有类型的胚胎干细胞和区域性多能干细胞进行强制性特性检测的论点，因为它们在体外繁殖可能产生胚胎干细胞或最终组织所不具备的新特性。特别是，人们认为，在含有细胞因子的培养基中长期培养会使胚胎干细胞系更接近肿瘤细胞，因为它们在细胞周期调控途径中经历了类似的变化，并获得了进行无限次细胞分裂的能力。一些作者认为，鉴于早期胚胎干细胞衍生物存在肿瘤发展的可能性，将其移植到人体是鲁莽之举。他们认为，使用胚胎干细胞的定向后代，即分化的祖细胞系，更为安全。然而，目前尚未开发出一种可靠的技术来获得能够稳定分化并达到预期方向的人类细胞系。

因此，越来越多的数据表明移植人类胚胎干细胞衍生物具有积极的治疗效果。然而，许多此类研究正在接受审查和批评。一些研究人员认为，早期临床试验的结果仅是初步的，仅表明干细胞能够对特定疾病的临床病程产生有利影响。因此，有必要获取细胞移植的远期疗效数据。临床神经移植学的发展阶段被引用作为论据。事实上，起初，关于移植胚胎脑碎片治疗帕金森病的高效率的出版物在文献中占主导地位，但随后开始出现否认将胚胎或胎儿神经组织移植到患者脑中的治疗效果的报道。

首批临床试验旨在评估NTERA-2畸胎瘤胚胎干细胞（ESC）衍生的神经母细胞移植的安全性。这些细胞的未成熟细胞在培养中增殖，直至积累到1亿个细胞团。部分细胞以此方式获得，用于表征表型、确定细胞杂质，以及检测是否存在病毒和细菌污染。从培养基中去除LIF和胎儿基质细胞的饲养层，并利用细胞因子和生长因子的组合，为ESC定向分化为神经母细胞创造条件。然后，在流式细胞分选仪上从未成熟畸胎瘤细胞中纯化神经母细胞。对移植细胞进行二次纯化和表型鉴定后，在立体定位和计算机断层扫描控制下，使用特殊的微插管和注射器将神经母细胞悬浮液（1000 万到 1200 万个）注射到患者脑基底核（出血性中风后第七个月）。移植后一年对中风区域神经元移植后果的筛查未发现任何副作用或不良反应。一半患者在移植后 6 至 12 个月内运动功能有所改善。细胞移植后，中风区域血液供应增加，伴随有积极的临床变化：根据正电子发射断层扫描，荧光标记的 2-脱氧葡萄糖吸收量平均增加 18%，部分患者甚至增加 35%。

然而，美国国立卫生研究院曾开展一项独立研究，探讨神经移植对帕金森病患者的临床效果。第一组患者接受了能产生多巴胺的胚胎神经组织切片移植，而第二组患者则接受了假手术。研究结果表明，尽管接受者脑内能够产生多巴胺的胚胎神经元存活下来，但神经移植的临床效果为零。此外，胚胎神经组织移植两年后，15%的患者出现了持续性运动障碍，而安慰剂组患者则没有出现这种情况（《干细胞：科学进展和未来研究方向》，美国国立卫生研究院）。目前，研究人员仍在观察这些患者病情的进一步发展。

一些作者认为，对神经移植临床效果进行评估的相互矛盾的文献数据与选择患者组的不同方法、客观评估其病情的方法选择不当有关，最重要的是，胚胎神经组织的发育时期不同，从大脑的不同区域获取这种组织，不同的移植大小和手术干预的方法特点。

值得注意的是，将多能胚胎干细胞直接移植到实验性偏侧帕金森病大鼠脑纹状体区域的尝试，伴随有胚胎干细胞的增殖及其向多巴胺能神经元的分化。可以推测，新形成的神经元已有效整合到神经网络中，因为在移植胚胎干细胞后，阿扑吗啡测试中观察到行为异常和运动不对称的纠正。同时，一些动物因移植的胚胎干细胞转化为脑肿瘤而死亡。

美国国家科学院和医学院的专家、美国国立卫生研究院的专家认为，胚胎干细胞的临床潜力值得最认真的关注，但坚持需要在适当的人类疾病生物模型上进行实验，详细研究其特性、并发症的可能性和长期后果（干细胞和未来的再生医学美国国家科学院出版社；干细胞和未来的研究方向美国国家卫生研究院）。

从这个角度来看，重要的是，对通过将ESC悬浮液移植到睾丸中获得的实验性畸胎瘤与通过移植也含有ESC的早期胚胎而形成的畸胎瘤进行的比较组织学分析表明，无论ESC的来源或与某些周围细胞的相互作用如何，它们都以相同的方式实现其致瘤潜力。已经证明此类畸胎瘤具有克隆起源，因为由所有三个胚层衍生物组成的肿瘤可以从一个ESC产生（Rega，2001）。值得注意的是，当将具有正常核型的克隆ESC移植到免疫缺陷小鼠体内时，也会形成由不同类型的分化体细胞组成的畸胎瘤。这些实验数据为畸胎瘤的克隆起源提供了无可辩驳的证据。从发育生物学的角度来看，他们指出，构成畸胎瘤的所有三个胚层的分化衍生物的来源不是多个定向祖细胞，而是单个多能干细胞。然而，在实际细胞移植的道路上，这些研究的结果如果不是禁止性的，那么就是潜在危险的警告信号，因为将 ESC 或原始生殖细胞接种到成年免疫缺陷小鼠的各种组织中不可避免地会导致移植干细胞发展成肿瘤。异位移植的 ESC 的肿瘤性退化伴随着分化细胞的卫星群的出现——这是由于 ESC 和祖细胞克隆部分分化为特化细胞系造成的。有趣的是，当 ESC 被移植到骨骼肌时，神经元通常在畸胎癌细胞旁边形成。然而，将胚胎干细胞引入分裂中的卵子或囊胚后，细胞会完全整合到胚胎中，而不会形成肿瘤成分。在这种情况下，胚胎干细胞几乎整合到胚胎的所有器官和组织中，包括生殖原基。这种异型胚胎动物最初是通过将畸胎瘤129细胞引入8-100细胞阶段的早期胚胎而获得的。在异型胚胎小鼠中，来自供体胚胎干细胞的异质细胞群整合到骨髓、肠道、皮肤、肝脏和生殖器组织中，这使得在实验中甚至可以创建跨物种的细胞嵌合体。早期胚胎发育周期越短，细胞嵌合率越高，在异型胚胎的造血系统、皮肤、神经系统、肝脏和小肠中观察到的嵌合程度最高。在成年生物体中，通过组织血液屏障保护免受接受者免疫系统侵害的组织易受嵌合体的影响：将原代生殖细胞移植到睾丸实质中，会伴随供体干细胞并入受体的生殖组织层。然而，将胚胎干细胞移植到囊胚中时，供体原代生殖细胞的生成不会形成性器官的嵌合体。胚胎干细胞的多能性在特殊条件下也可用于克隆：将小鼠胚胎干细胞移植到8-16细胞的小鼠胚胎中，由于细胞有丝分裂被细胞钙化蛋白阻断，这促进了正常的胚胎发生，并最终从供体胚胎干细胞发育成胚胎。

因此，异基因胚胎干细胞移植的一种替代方案是治疗性克隆，即将体细胞核移植到去核卵子中，形成囊胚，然后从囊胚的内细胞团中分离出与体细胞核供体基因相同的胚胎干细胞系。从技术上讲，这个想法完全可行，因为将体细胞核移植到去核卵子中，再从囊胚中构建胚胎干细胞系的可能性已在动物实验中得到反复证实 (Nagy, 1990; Munsie, 2000)。具体而言，在携带rag2基因突变的纯合子小鼠中，将通过培养表皮下组织细胞获得的成纤维细胞作为细胞核供体，并将其移植到去核卵母细胞中。卵母细胞激活后，将“受精卵”培养至囊胚形成，从内细胞团中分离胚胎干细胞（ESC），并移植到突变基因（rag2~/~）无效的细胞系中。通过同源重组的方法，纠正了这些ESC中一个等位基因的突变。在第一组实验中，从带有重组修复基因的ESC中获得胚状体，用重组逆转录病毒（HoxB4i/GFP）转染其细胞，繁殖后注射到rag2~/~小鼠的静脉中。在第二组实验中，将四倍体胚泡与转基因ESC聚集，移植到受体雌性小鼠体内。由此产生的具有免疫功能的小鼠作为骨髓供体，移植到rag2~/~突变小鼠体内。在两个系列实验中，结果均为阳性：3-4周后，所有小鼠体内均发现了能够产生免疫球蛋白的成熟正常的髓系和淋巴细胞。因此，将体细胞核移植到卵母细胞中不仅可以用来获得胚胎干细胞系，还可以用于细胞遗传学治疗——利用胚胎干细胞作为传递矫正遗传信息的载体来纠正遗传异常。但是，这种细胞移植方向除了生物伦理问题外，还有其局限性。目前尚不清楚移植与特定患者基因型相同的治疗性克隆细胞的安全性，因为这些细胞可能会引入突变，导致易患其他疾病。正常的人类卵子仍然难以获得，而即使将体细胞核移植到去核的动物卵子中，也只有15-25%的受精卵能够发育到囊胚阶段。目前尚不清楚获得一个多能性克隆胚胎干细胞系需要多少个囊胚。同样值得注意的是，治疗性克隆方法的复杂性与高昂的财务成本相关。

总而言之，需要注意的是，胚胎干细胞（ESC）中，低甲基化DNA的基因组多能性与高端粒酶活性和较短的细胞周期C^期相结合，确保了其密集且可能无限增殖。在此期间，ESC保留了二倍体的染色体组和“幼年”表型特征。当增殖停止并添加适当的调控信号时，ESC在培养中的克隆生长不会干扰其分化为任何生物体特化细胞系。ESC在体外向体细胞系的限制性分化无需间充质参与，绕过Nochteys，在器官发生之外，无需胚胎形成。ESC异位移植到体内不可避免地会导致畸胎癌的形成。将ESC移植到囊胚或早期胚胎中，会伴随其与胚胎组织整合并与其器官稳定嵌合。

基于细胞移植的再生塑性技术是细胞生物学、发育生物学、实验遗传学、免疫学、神经病学、心脏病学、血液学以及实验医学和实用医学等众多分支学科代表学者研究兴趣的交汇点。实验研究最重要的成果证明了对干细胞进行重编程并有针对性地改变其特性的可能性，这为利用生长因子控制细胞分化过程——例如心肌再生、中枢神经系统病变修复以及胰腺胰岛功能正常化——开辟了前景。然而，为了将胚胎干细胞（ESC）衍生物移植广泛应用于实用医学，有必要更深入地研究人类干细胞的特性，并继续在实验疾病模型上开展胚胎干细胞实验。

生物伦理问题和同种异体细胞移植的排斥问题可以通过发现成体生物体局部干细胞基因组的可塑性来解决。然而，最初的信息是，当将分离的、仔细鉴定的自体造血细胞移植到肝脏中时，从中可以衍生出新的肝细胞，这些细胞会整合到肝小叶中，现在正受到修改和批评。尽管如此，已有数据表明，将神经干细胞移植到胸腺中会导致新的供体T细胞和B淋巴细胞芽的形成，而将脑神经干细胞移植到骨髓中会导致造血芽的形成，并可长期进行供体的髓系和红细胞生成。因此，能够将基因组重编程为胚胎干细胞潜能的多能干细胞可以在成体生物体的器官中存活。

用于医疗目的的胚胎干细胞（ESC）的来源仍然是人类胚胎，这预示着在人类生命起源之时，道德、伦理、法律和宗教问题必然会交织在一起。ESC的发现有力地推动了关于活细胞与物质、生命与人格之间界限的艰难讨论的重启。与此同时，尽管人们一再尝试制定和采用ESC在医学中的应用，但至今仍未形成统一的规范、规则和法律。各国在其立法框架内各自解决这个问题。而世界各地的医生则继续尝试将再生医学推向此类讨论的范围之外，他们主要通过使用成体干细胞储备而非胚胎干细胞。

胚胎干细胞分离的一点历史

畸胎瘤（胚胎）癌细胞是从129/ter-Sv小鼠自发性睾丸畸胎瘤、Lt/Sv小鼠自发性卵巢畸胎瘤以及异位移植胚胎细胞或组织来源的畸胎瘤中分离出来的。通过这种方式获得的稳定小鼠畸胎瘤（胚胎）癌细胞系中，有些具有多能性，有些仅能分化成一种特定的细胞类型，还有一些完全无法分化。

当时，研究重点是那些结果表明畸胎癌（胚胎癌）细胞在被引入发育中胚胎的组织后有可能恢复正常表型的研究，以及体外创造转基因畸胎癌（胚胎癌）细胞的研究，借助这些研究可以获得突变小鼠，用于对人类遗传病理进行生物建模。

采用条件悬浮培养法分离畸胎癌（胚胎癌）细胞系。在培养条件下，畸胎癌（胚胎癌）细胞与胚胎干细胞（ESC）类似，会生长形成胚状体，需要强制分离才能进行细胞系转移，从而在胚胎成纤维细胞饲养层或条件培养基中悬浮培养时保持多能性。多能畸胎癌（胚胎癌）细胞系细胞体积大，呈球形，具有高碱性磷酸酶活性，可形成聚集体并具有多向分化能力。当被引入囊胚后，它们会与桑葚胚聚集，从而形成嵌合胚胎。在各种器官和组织的组成中，可以发现畸胎癌（胚胎癌）细胞的衍生物。然而，绝大多数此类嵌合胚胎会在子宫内死亡，在存活的新生嵌合体器官中，很少检测到外来细胞，且密度较低。同时，肿瘤（纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、其他类型恶性肿瘤及胰腺腺瘤）的发病率急剧上升，嵌合胚胎在宫内发育期间常发生肿瘤退变。

正常胚胎细胞微环境中的大多数畸胎癌（胚胎癌）细胞几乎自然地获得了恶性肿瘤的特征。人们认为，不可逆的恶性肿瘤是由于结构重排过程中原癌基因的激活所致。胚胎癌系SST3细胞是一个例外，该细胞取自小鼠睾丸畸胎瘤（129/Sv-ter系），它表现出很强的整合能力，能够融入胚胎的组织和器官，而不会在嵌合小鼠中形成肿瘤。嵌合小鼠中的畸胎癌（胚胎癌）细胞系衍生物几乎不参与原代生殖母细胞的形成。显然，这是由于大多数畸胎癌（胚胎癌）系的染色体畸变率较高，在这些细胞中同时观察到非整倍体和染色体异常。

在实验室条件下，获得了几种稳定的人类畸胎癌（胚胎癌）细胞系，这些细胞具有多能性、高增殖活性以及在培养生长过程中分化的能力。特别是，人类畸胎癌（胚胎癌）细胞系 NTERA-2 被用于研究神经细胞分化机制。将该细胞系的细胞移植到新生大鼠前脑的脑室下区域后，观察到了它们的迁移和神经发生。甚至尝试将通过培养畸胎癌（胚胎癌）细胞系 NTERA-2 的细胞获得的神经元移植到中风患者体内，据作者称，此举改善了疾病的临床病程。同时，在中风患者体内没有发现移植的畸胎癌（胚胎癌）细胞系 NTERA-2 发生恶性肿瘤的病例。

20世纪80年代初，Evans和Martin从囊胚的内细胞团（胚泡）中分离出首批未分化的多能性小鼠胚胎干细胞系。分离出的ESC系在特殊培养基中，长期保持多能性，并能在各种因素的影响下分化成各种细胞类型。

“胚胎多能干细胞”这一术语本身属于 Leroy Stevens，他在研究烟焦油对肿瘤发生率的影响时，注意到对照组线性（129/v）小鼠中自发发生了睾丸畸胎癌。睾丸畸胎癌细胞的特点是增殖率高，在腹腔液体存在下，它们自发分化，形成神经元、角质形成细胞、软骨细胞、心肌细胞以及毛发和骨碎片，但没有相应组织的有序细胞结构迹象。在培养基中，畸胎癌细胞作为不附着于基质的多能克隆生长，形成胚状体，之后它们停止分裂，并自发无序分化为神经元、神经胶质细胞、肌肉细胞和心肌细胞。 Stevens发现，小鼠畸胎癌129/v中，只有不到1%的细胞能够分化成各种特化的体细胞系，而分化本身取决于影响这些细胞的因素（腹腔液的成分、添加到培养物中的成熟细胞或组织的产物）。Leroy Stevenson关于畸胎癌细胞中存在生殖系胚胎祖细胞的假说得到了证实：将来自植入前胚胎的胚母细胞悬浮于成年小鼠的组织中形成了畸胎癌，而将来自这些胚胎的纯细胞系腹膜内注射到受体动物体内后，这些纯细胞系分化成了神经元、心肌细胞和其他来自所有三个胚层的体细胞。在体内实验中，将胚胎干细胞（ESCs，取自胚泡，而非滋养层）移植到另一系小鼠8-32个胚泡期的胚胎中，产生了嵌合体动物（未形成肿瘤），其器官中发现了供体组织的芽体。甚至在生殖细胞系中也观察到了嵌合现象。

从小鼠胚胎生殖器残基中分离的原代祖生殖细胞在形态学、免疫学表型和功能特征上与Stevenson从畸胎瘤和胚细胞中获得的胚胎干细胞（ESC）一致。在将ESC引入囊胚后产生的嵌合体中，器官的异型形态发生以供体和受体的结构和功能单元（肝脏、肺和肾脏）的镶嵌交替为特征。在某些情况下，观察到由受体和供体细胞组成的肠隐窝或肝小叶的形成。然而，形态发生总是根据受体所属物种的遗传程序实现的，嵌合现象仅限于细胞水平。

随后，研究人员发现，在选择性培养基中，LIF 的存在会选择性地确保干细胞和祖细胞存活，而绝大多数特化细胞则会死亡，从而导致未分化的胚胎干细胞在间充质来源细胞（胎儿成纤维细胞）的饲养层上增殖。1998年，James Thomson 利用这种方法从人类囊胚的内细胞团中分离出五株永生化的胚胎干细胞系。同年，John Gerhart 开发了一种从四到五周龄人类胚胎的生殖结节中分离永生化胚胎干细胞系的方法。由于其独特的特性，仅仅两年后，胚胎干细胞和成熟组织干细胞就开始被用于再生医学和基因治疗。