胚胎幹細胞

胚胎幹細胞的發現 - 沒有意外，出現在發育生物學研究領域的準備土壤研究。早在1908年在亞歷山大·馬克西莫夫（Alexander Maksimov）的柏林血液學會大會上就造血細胞介紹了“幹細胞”一詞。很久以前，在研究過程中的早期開發的分離和製備的多能胚胎幹細胞的穩定系使用幹terato-（胚胎癌細胞與研究胚胎發育的未知的機制，包括早期的基因和他們的工作的蛋白質產物的表達的序列。

但是在進化過程中，人類基因組的全能性是不可挽回的嗎？不，胚胎髮育是證明。如果情況如此，那麼原則上何時才能實現進化發展的第二條道路？也許，當一個人離開宇宙時，那裡的環境條件將會持續相當長時間。骨損失（骨質脫鈣在失重狀態）非常緩慢地適合重塑和再生可以被認為是所述第一步驟到人類適應過程如在空間中的物種的存在。然而，進化發展的第二條道路的支付方式將會不同 - 無菌性將成為返回所有細胞全能性和絕對可塑性的代價。所以在這個“進化變色龍”的世界中繁殖不會有減數分裂，otpochkovaniem。但我們會活得很久。端粒酶不朽是阿米巴的不朽。在多細胞生物中，幹細胞是定量和定性壽命的基礎。

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胚胎幹細胞的來源

用於實驗室測試胚胎幹細胞的今天源線鼠畸胎癌（129 / SV，F19，F8，尋40，CGR 86，RL，CCE，JM-1，E14TG2a，CGRSb）和人畸胎癌（NTERA-2，TERA-2 ，H-9克隆），以及HESS Trauneona。然而，存在詳述蜂窩護照指示免疫表型，暴露受體和蛋白的細胞內信號不補償teratokartsinomnyh線ESC顯著缺點mRNA表達譜染色體分析結果 - 全能性，並在臨床試驗中應用的可能性的快速損失，並混合分化培養物中是非常難以分離來自異質細胞群體的純專業線。因此，生產用於臨床目的通常是源ESC系，作為胚泡的內細胞團，胚胎發育的8細胞期的個體的卵裂球，細胞桑椹胚後期階段，和初級生殖細胞。

應該注意的是，畸胎癌細胞儘管具有多能性特性，但與ESC相比具有顯著較低的多能性。它們與胚胎細胞的整合很少導致嵌合體的形成，此外，具有畸胎瘤細胞基因型的配子永遠不會形成。據信這是由於染色體異常在染色畸胎瘤細胞培養中頻繁出現：Y染色體丟失，各種三體性，缺失或易位。

試圖區分人類ESC系已經進行了很多次，但這項任務無法解決，因為正常人類囊胚很難接近物體。另外，在人類中，染色體異常的頻率比動物的胚胎髮生頻率高。體外受精後獲得的絕大多數早期人類胚胎表現出混亂的染色體鑲嵌現象，並且經常存在數值和結構畸變。甚至以後，在囊胚階段，只有20-25％的人類胚胎由具有正常核型的細胞組成。使用這樣的胚胎來創建ESC幾乎是不可能的，因為合子通常被培養成兩個或四個卵裂球的階段，然後移植到子宮中。直到最近才開發出一種可靠的技術，用於將受精卵胚珠培養成胚泡階段。將該技術引入體外受精實踐中不僅增加了成功植入結果的頻率，而且使正常囊胚成為更容易接近的對象。

另一個多能幹細胞的來源是原發性性細胞，其中，與更先進的祖細胞群germenativnogo上皮，都沒有的β-整合素的表面上，但表達高活性shelochnoy磷酸酶。應該指出的是，在實驗中，自上世紀80年代以來已經研究了由原代性細胞形成的干細胞群體。與此同時，還開發了一種從初生小鼠胚胎生殖腺中分離出初級生殖細胞的技術。在體外培養原始生殖細胞的第一次不成功的結果表明，這些努力是徒勞的，因為細胞，雖然活了下來，但不增殖，第一天之內死亡。後來發現小鼠原代生殖細胞僅在培養基中存在可溶性和膜結合特異性多肽生長因子的情況下體外繁殖。許多研究已經表明，有必要在培養基中不僅LIF的存在，但membrannosvyazannyh和原始生殖細胞的存活和增殖鋼可溶性因子（SIF）。這些肽是由Steel突變純合胚胎的體細胞產生的，其中一個是原癌基因cKit的配體。

哺乳動物和人類的原代生殖細胞來源於extragonadal，並且是性細胞系克隆發育的來源。主要生殖細胞系的開始，以及胚胎的所有組織以及胚外中胚層，給出具有鑲嵌結構組織的早期胚胎的外胚層（初級外胚層）。早期胚胎各部分的顯微外科切除在原生殖細胞定向前體克隆的外胚層中建立了定位區。在用作細胞標記物的羅丹明葡聚醣的幫助下，確定了主要有性細胞的前體位於胚外外胚層旁邊的近端外胚層區域中。主要的有性細胞係來自45細胞克隆，其分配發生在原腸胚胎初始階段。然後發生剋隆分離，並且在原腸期間，主要性細胞進入胚外中胚層並且在主要帶背後的尿囊芽基部中發現。從那裡，主要生殖細胞向內胚層內胚層的腹側端遷移，然後沿著腸系膜主動移動，在遷移結束時填充生殖器滾筒。在遷徙過程中，以及在性腺初生階段的2-3天內，主要的有性細胞活躍增殖並經歷8個複制週期。如果在遷移開始時有大約50個主要生殖細胞，在12天發育的小鼠胚胎的生殖囊中，原發性細胞的數量超過25,000個。

胚胎幹細胞和原始生殖細胞的功能相似性表明，在更換胚泡內細胞團的完全集成後者的和胚，組織，其僅由後代原始生殖細胞的隨後的全面發展。根據其它特徵鼠原生殖細胞的PGC也相同，顯示出分化成不同的方向，在體外形成胚狀體的能力，當皮下注射入免疫缺陷小鼠類似自發畸胎瘤睾丸小鼠線129 /叔一個在體內形成畸胎瘤。

已經確定，當加入到LIF培養基中，可溶性membrannosvyazannogo SIF分離8天的小鼠胚胎存活並在培養物中增殖4天但是然後死亡的主要生殖細胞。此外，當死亡的培養觀察到原始生殖細胞的週期與小鼠胚胎（12.5-13.5天）的發展階段，當芽原發性性腺雌性生殖細胞進入減數分裂，而在雄性原始生殖細胞被阻斷有絲分裂相一致師。但是，如果添加到環境中，不僅生長因子LIF SIF的和，也FGF2的，主要的生殖細胞繼續proliferirovat，和亞文化形成細胞集落，甚至可以從生長因子（SIF和FGF）環境中取出後重現。這種細胞可以在胚胎成纖維細胞底物上長時間培養，而不添加可溶性生長因子LIF。這些穩定的細胞係來源於原始生殖細胞，被認為被稱為胚胎生殖細胞。這個術語不能被認為是成功的，因為當培養EG細胞時不可能產生胚胎生殖細胞，其可以進行隨後的卵子發生或精子發生階段。這是由於一個事實，即EG細胞系，雖然從原始生殖細胞的，但在獲取胚胎多能幹細胞的性質的文化失去了對犯germenativnye線的能力。換句話說，原代性細胞在培養時失去配子前體的特性並轉化為ESC樣多能細胞。

注意到當施用免疫缺陷的EG小鼠時，畸胎瘤不會出現。據推測，人類EG細胞引發畸胎瘤的能力喪失是由於這些細胞係不是直接從培養的初級生殖細胞產生的，而是從分離自胚狀體的細胞獲得的。因此，它們可能是多能的後代，但已經是承諾的細胞。

應該指出的是，EG細胞和原始生殖細胞之間存在根本差異。後者不能獲得嵌合小鼠胚胎，這表明初級生殖細胞缺乏整合入內部細胞團或滋養外胚層的能力。原發性細胞群的特徵與晚期胚胎的體細胞的定型系更類似，其引入囊胚也不會導致嵌合胚胎的形成。

改性技術培養用由選擇在選擇培養基上允許接收多能細胞的另一細胞群體的EG-聚合獲得的胚狀體，稱為從胚狀體（胚狀體的細胞 - EBD細胞）衍生的“細胞。EBD細胞在培養物中長時間繁殖的能力允許產生穩定的定型細胞的細胞系。獲得表達廣譜的特定細胞的mRNA和蛋白質標記的細胞克隆。這種方法作為結果證明，主要性別人多能細胞，並在體外分化成各種細胞類型：神經元，神經膠質，血管內皮細胞，造血細胞，肌肉和內胚層細胞。

胚胎幹細胞的替代來源

人類ESC系的替代來源可以是雜交細胞。植入到通過電穿孔fetusa人類體細胞與卵牛，已預先從原核除去合併時得到的假孕牛geterogenomnoy結構的子宮，使得能夠接收移植前胚胎的人造發育階段的內細胞團。為此，在第一階段獲得來自具有移植的人類細胞核的奶牛卵的胚泡。

在第二階段，從囊胚中提取胚胎細胞，並根據Thomson方法從胚胎中提取ESC。值得注意的是，在分離ESC線最好的結果通過該方法，使用濾泡細胞或原始生殖細胞，在人體中持續存在冬眠狀態的芯而獲得。這是由於這樣的事實，母牛的卵移植的人細胞細胞核neukorochennye應具有高的活性和端粒telomeazy避免從混合蛋（列賓，2001）衍生的過早老化ESC克隆。已知最重要的胞內標誌物EGF蛋白質是屬於所謂的染色質沉默子蛋白質的Oct3，Oct4，Tcf，Groucho。消音器提供特別緊密的異染色質填充，防止形成常染色質環。這些蛋白質介導的染色質包與ESC基因組的全能性相關。迄今為止，已確定牛和人的成熟胚珠是細胞質中含有高濃度沉默子蛋白質的唯一類型的特化細胞。在此基礎上，通過將體細胞核轉移到母牛的非核胚珠，開發了一種生產雜合胚胎幹細胞的方法。體外初步研究表明，母牛卵細胞的細胞質在12-24小時的培養中恢復人體細胞核基因組的全能性。

特別令人感興趣的是人胚胎植入前發育特徵的數據，這表明後來用多能細胞群替代全能細胞比在小鼠中更多。細胞轉化的研究表明，人胚泡內細胞團的細胞除了胚胎幹細胞之外，還產生滋養層細胞，這表明它們的總效力。

已知在胚泡階段有兩種不同定型的細胞群體。其中之一是囊胚的外層，trofectoderm，源自滋養層細胞和其他胚胎胎盤成分。第二組細胞被分組成密集的質量，其接觸滋養外胚層的內表面。內細胞團的細胞群來源於胚胎器官的所有組織和細胞。在胚泡晚期階段，由內部細胞團形成胚外內胚層並形成外胚層（初級外胚層）。同時，外胚層細胞保持多能性，而區分外胚層內胚層細胞的能力是有限的。

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獲得人類胚胎幹細胞

直到最近，它被認為是由hESCs不可能得到滋養。從胚泡中含有培養基中分離，而不是LIF和FGF2肝素，但是二倍體線滋養外胚層幹細胞，增殖和被轉化為幹細胞。如果從FGF2的中間除掉，滋養外胚層細胞停止繁殖，就開始染色體和蜂窩元素內複製trofektodermalnye逐漸變成一個巨大的滋養層細胞。大概，LIF不刺激滋養外胚層細胞的增殖是由於該FGF2觸發機制transsignalizatsii如FGF2，結合於細胞質受體（FGFR2），激活在細胞質中MAP激酶的事實 - ERK1和ERK2。因此，當結合到一個信號轉導途徑的胚泡的細胞（LIF - gp130的 - JAK激酶 - STAT3）內細胞團的細胞被轉化為多能性胚胎幹細胞，同時激活的跨膜信號傳遞的第二機構（FGF2 - FGFR2 - MAP激酶ERK1 / ERK2）莖在形成胚泡滋養外胚層細胞。該信號通路的選擇，反過來，依賴於基因OCT4的活性。該基因屬於POU域，位於軌跡噸17常染色體和卵子發生過程中表達，在粉碎期間，以及在胚泡的內細胞團的細胞，以及在原始生殖細胞。功能作用OCT4基因編碼必需的多潛能細胞，其分化和去分化發生的轉錄因子。

ESC中oct4基因的表達根據該轉錄因子與輔因子的相互作用而變化。Oct4表達在囊胚中的定向調節表明，當其活性降低時，一半細胞形成滋養外胚層，而隨著Oct4誘導表達的增加，主要發生ESC。

在實驗中，在破碎階段以及原腸胚階段和胚胎髮育的後期階段培養全能卵裂球時，ESC不能轉化成線。小鼠胚胎幹細胞通常分配在妊娠3.5-4.5天，這對應於正常胚胎髮生的第六階段（單層胚泡）和第七階段（雙層囊胚 - 早期的卵圓柱體）。顯然，只有在植入前期，小鼠的胚胎才含有可轉化為ESC的細胞群。因此，僅在胚胎髮生的某些階段才可能分離ESC系。從胚胎膜和胎盤發育成活胚胎的可能性來看，Totitipotent是合攏和粉碎期間產生的卵裂球。當進一步的卵裂球粉碎取決於它們的位置時，生殖細胞總效力的喪失開始於桑late胚晚期階段。早期的Morula blaetomers保留全能性，因為實驗操作隨其位置的變化而變化，例如，它們的位置顛倒，並不妨礙完整胚胎的發育。

發現該系中ESC釋放的效率受到胚泡在其移出時的狀態的影響。在妊娠第3.5天卵巢切除並接受孕酮的小鼠的生殖道模型中建模7天后使用囊胚促進胚胎幹細胞系更成功的分配。假定在這種條件下，形成內部細胞塊的卵裂球的數量增加。細胞週期延長並且大部分卵裂球進入G0期也是可能的。

此外，穩定的多能性hESC細胞系的產生依賴於基因型的胚胎：相當容易地從胚胎幹細胞的小鼠胚泡線129區分，是顯著更難以用小鼠CS7BL / 6和幾乎是不可能的，分離從hESC胚泡CBA /鈣小鼠線，以獲得它們。顯然，早期胚胎具有影響多能ESC線發育的一些遺傳特徵。然而，當培養的胚層絕緣，以及通過選擇性選擇從早期胚胎分化的hESC細胞系CBA /鈣小鼠仍然被分配。

實驗室手冊中提供了一種從囊胚中獲得ESK細胞系的已被證實的標準技術，其中涉及早期胚胎的實驗技術。通過用相當複雜的顯微外科技術和修改的培養條件培養4.5天小鼠胚胎的分離的外胚層（初級外胚層）也可以獲得實驗性ESK系。這一過程的複雜性是合理的，因為ESC系的形成頻率遠高於囊胚內細胞群的工作頻率。

為了分離ESC系，將每個克隆轉移到微孔中，生長40-60個細胞的聚集體，再次分散。此過程的多次重複允許獲得與附連到塑料，它通過通道50-100保留全能性和高端粒酶活性最大增殖速率normokariotipnyh細胞永生化的ESK線。在支持ESC系統的過程中，環境或血清對細菌內毒素的污染是最危險的 - 即使培養基中痕量濃度的內毒素也會導致未成熟的生殖細胞大量死亡。與線性生長和培養ESC的及時分散小心控制能夠對稱裂變，其中兩個子細胞保持多能性和能夠執行細胞週期的數量不受限制，維持二倍體核型和總效力。

在將含有編碼綠色熒光蛋白（GFP）合成的基因的重組DNA分子轉染至其基因組後，可以選擇乾淨的人類ESC細胞群。在支持其增殖的條件下，GFP表達隨著ESC的生長而增加，而隨著分化的開始，該基因的表達水平降低，這允許在選擇性培養基上選擇純的穩定的多能細胞系。當用GFP選擇ESCs培養時，菌落頻率大大增加，因為在選擇作物條件下，分化細胞的強抗增殖作用被消除。

可以通過植入前胚胎（步驟80-120細胞），其保持在體外受精程序後的分離方法的裝置在管線人胚胎幹細胞的翻譯。為此，將人工獲得的“過量”胚胎機械分散在Delbecco-Needle環境中。用具有熒光標記的選擇性單克隆抗體標記細胞後，分離胚胎細胞。使用disaspase-膠原酶的混合物將胚胎成分分散到單個細胞中。將解離的細胞中（在500微克/ ml的IL-6，LIF和SCF的存在下80％Delbekko介質+ 20％胎牛血清）上胚胎成纖維細胞的單層特殊培養基中生長供給部3的第一通道。在這種情況下，幹細胞和祖細胞的存活和增殖通過暴露於IL-6，LIF和SCF而得到支持。在這樣的環境中，胚胎幹細胞通過懸浮的未附著的刮細胞克隆來生長，其必須通過輕柔的多次移液來分離。5日至7日，新的克隆出現在懸浮培養物中。ESC的最大生長速率是通過在10-15個細胞階段重複分離克隆實現的。然後，將每個克隆轉移至微細胞並生長至40-50個細胞的聚集體。該過程在傳代中重複許多次，將培養物體積增加至每6厘米杯子5-10百萬個細胞的密度。通過使用這樣的湯姆森傳代它在任何被得出，350專門的細胞系的分離10個克隆永生化人胚胎幹細胞，其通過通道100保持高端粒酶活性，能夠將強烈增殖和表型特徵最小總效力，具有分化體外寄生蟲，內消旋 - 和內胚層。人ESC的分化開始時（在介質中，除和消除血清LIF的變化）與細胞附著到襯底，這表明粘附受體的細胞骨架和表達的發展。重要的是，隨著人類胚胎幹細胞的不受限制的增殖，正常的核型被保留下來。

分離人ESC系的第二種方法是基於使用原代性細胞。實驗研究表明，可以從12.5日齡小鼠胚胎的生殖器斑塊獲得Eu-細胞系。然而，在這些情況下，祖細胞系的形成頻率明顯低於早期胚胎的實驗。同時，來自13.5天胎齡的小鼠胚胎性腺的原代性細胞通常不能轉化為系。

多能人EG細胞的第一批穩定細胞係從從5-9週齡胚胎的生殖芽中分離的初級母細胞獲得。分離的細胞與胎兒血清的DMEM培養基中滅活小鼠胚胎成纖維細胞的基板上進行培養，向其中加入巰基乙醇，毛喉素，以及重組人類生長因子（FGF和LIF）。根據對應於人EG細胞的形態特徵和分子標記，7-12天后，多細胞集落出現在培養物中。聚集後，這些細胞形成胚狀體，隨著進一步發育，出現了特化細胞，其特徵在於所有三個胚葉的衍生物。在整個10-20代中，EG細胞系保持正常的核型並且不喪失多能性。

還顯示LIF，膜結合和可溶性鋼因子以及TGF-β的組合作用改變了原發性生殖細胞發育的程序。除了停止有絲分裂並開始分化為卵子發生或精子發生外，原代性細胞繼續增殖。經過幾次額外的有絲分裂週期後，它們變得與上胚層細胞相似，並喪失了生殖細胞前體的特性，被轉化為多能胚胎幹細胞EG細胞。

因此，1998年，首先從人類胎兒屍檢組織的性遺傳中分離出永生化的原代有性細胞系。人原發性生殖細胞的胚胎發育出現在發展的第三個星期的卵黃囊，並在4-5th週，這些細胞遷移到性結節的區域，在那裡形成主要dormantnye生殖母細胞的群體。在無活性狀態下，初生細胞在出生前一直處於萌芽狀態。主要胚細胞系購自檢索前臨時織物，其與IV型膠原酶-V，透明質酸酶和DNA酶的定量和定性的增加細胞產量的混合物處理的胎兒生殖結節5-9週齡胚胎萃取。胎兒生殖器結節組織中的原始生殖細胞被Sertoli基質（間充質）細胞包圍。支持細胞功能的目的是生產抗凋亡因子（FAS配體），有絲分裂原，以及保護性幹細胞被人體免疫攻擊的免疫抑製劑。此外，生殖器結節的基質微環境對配子的成熟起著重要作用。將分離的原代生殖細胞種植在由前三代的胎兒成纖維細胞構成的飼養層基質層上的培養物中。促細胞分裂素最有效的組合是由LIF，FGF和毛喉素（cAMP形成的興奮劑）組成的複合物。體外增殖原始生殖細胞需要添加胎牛血清的，在伴隨著形成球狀，非貼壁細胞向基底中培養克隆的主再現生殖母細胞的存在。

總結從胚泡人類ESC行分配的方法從現有信息的基礎上健康的美國國立衛生研究院是做了一個初步的結論，即ESC成功的分配是最有可能在與形成良好的內細胞團培養的囊胚（幹細胞：科學進展和未來的研究方向Nat。Inst，美國衛生部）。從這個角度來看，胚胎幹細胞的最佳來源，以創建線的發展，其中的內細胞團的分配應仔細去除滋養外胚層的人胚泡第5天。由在此階段30-35分離的細胞內細胞團必須在襯底的鼠胚胎成纖維細胞，其是用於在培養的hESC集落的形成的決定性條件進行培養。

胚胎幹細胞的表型特徵分析

特別感興趣的是ESC的表型特徵的種間比較分析。結果發現，人ESC集落 - 扁平上皮細胞的緻密簇，而小鼠胚小牛由圓形細胞的鬆散礫岩。在人ESC中，核 - 血漿比率的指數低於小鼠ESK中的指數。猴子的胚胎幹細胞形成更平坦的細胞集落，邊緣不平整。在早期的ESC靈長類克隆中，單個細胞很容易看到。所研究的所有動物物種的增殖ESC不表達第一和第二類的MHC分子。同時，人ESC給予抗體TERA 1-60和GCTM-2的積極響應，其指示在其表面上的角蛋白/硫酸軟骨素蛋白聚醣，胚胎（畸胎瘤）的特性-kartsinomnyh幹細胞的存在。在人類胚胎幹細胞表達各種動物Oct4基因的表明，儘管在人類和小鼠胚胎幹細胞的表型差異，顯然是由同一組負責維護多能性（秘魯，2001年）的基因的激活。另外，從大鼠胚胎，豬，兔，靈長類動物和家畜產生的ESC線，也有類似的形態特徵，一組類似的標記的分子識別以及在胚胎發育計劃的實施，可以讓你重新審視在異種移植的問題幾乎相同的分子機制。

不像在體內正常胚胎發生，胚胎幹細胞的體外增殖不伴隨胚層的形成，並進行到框同源異型Nohgenov背景，即，沒有器官。由於分割基因不在培養人類胚胎幹細胞的作用不可能再現這樣的時期胚胎發生為核的選項卡分割體節，卵黃囊，尿囊provisory和其他器官和組織的形成。培養ESCs在350個特化細胞限制系的形成開始時被冷凍。因此，克隆附屬祖細胞和居中定位的PGC是開發過程中只有模胚其中在一個階段中形成的不同的組織區域是衍生自特化的細胞不同，但是，從共同的前體。雖然胚胎幹細胞的表面上的受體的最低水平，它們保留以執行原始形態發生過程模擬散裝早期胚胎結構的能力：在培養物和聚集體的漿料的hESC形成結構類似於胚泡或甚至更高的胚胎（蛋氣缸）。這種懸浮聚集體被適當地命名為簡單和復雜的胚狀體。

當混合分化成同時通過早期基因外胚層（OCT3，FGF-5，節點），內胚層（GATA-4），中胚層（短尾），心源性中胚層（PKH-2,5），神經管（msx3表示的胚狀體的各種細胞）和造血（elkf）。使用的細胞因子和生長因子的各種組合用於在數有可能獲得的胚狀體的情況下，將其優選地表達的基因外胚層或中胚層，這將打開的方式來原腸胚形成和早期器官相的建模的靶向胚層細胞的體外形成。

人類胚胎幹細胞的克隆生長是不對稱細胞分裂，其中僅ESC在中心克隆之一保持非限制性繁殖能力的證據，而另一子細胞產生了生成祖細胞的分化已經在到來。因此，擬胚體周邊的克隆繁殖率高於中心。生長的克隆的邊緣細胞經歷自發的無序分化，通過凋亡機制遷移或死亡。這些過程的倒檔傳動比 - 這些事件確定克隆的命運如果增殖速率超過遷移和凋亡性細胞死亡的速率，克隆尺寸繼續增加，穩定化以相等的細胞凋亡和形成新的小區速度，回歸的速率發生。祖細胞對稱分裂，即兩子細胞進一步分化為成熟的特化細胞系。ESC /祖細胞的比例變化，但ESC總量僅為祖細胞群體百分比的一小部分。因此，只有仔細移液和及時分解克隆才能增加培養的ESC的數量。為了獲得ESC的最大產量，最有效的是在10-12個細胞階段克隆的分解。胚狀體內細胞的分化方向和程度取決於它們的位置。外胚狀體細胞不表達的基因和Oct4在從該隨後形成的上皮樣細胞與壁胚外內臟內胚層的主要胚層細胞進行分化。胚狀體的內部細胞表達oct4基因並保持48小時培養的多能性。然而，然後在上皮單層中發生培養物的形態重排，並且控制初始外胚層發育的基因的表達開始。然後開始全面無序的細胞分化過程，並出現各種細胞類型，它們是所有三個生髮片的衍生物。在胚狀體細胞自發分化的過程產生第一聚集體內胚層標誌在片段（囊腫）卵黃囊的形式。此外，這些結構中出現成長毛細血管的成血管細胞和內皮細胞。在胚狀體的內部細胞自發分化的最後階段開發各種終末分化細胞，包括神經元，神經膠質元件，心肌細胞，巨噬細胞和紅細胞。在某些近似（考慮形成胚胎組織片的空間反轉）通過體外胚狀體可以探索形態發生的過程和分析胚胎細胞分化初期的分子機制，並建立在這些方法的實施的具體基因的作用。

因此，克隆內部是發現不同遺傳發育程序的細胞 - 胚胎幹細胞，早期祖細胞和分化祖細胞群。通過下垂或大量培養而沒有飼養層並且在培養基中不添加LIF的方法培養ESC不可避免地導致胚狀體的形成。胚狀體外層和內層細胞的形態不同。外層由大型過程單元組成。它們的表面面向環境，覆蓋著許多微絨毛。細胞的外層與類似Reichert膜的內部基膜分離，而胚狀體內層的細胞是圓柱形上皮。形態上，內層雖然含有許多分裂細胞，但更令人聯想到未分化的ESC菌落。

人類胚胎幹細胞的特徵

在不存在的背景信號阻擋基因同源異形導致培養PGC的無序生長，因為該標籤被破壞，形成基礎設施provisory器官實質 - 間充質相互作用的。無組織的生長和文化由於缺乏骨髓間充質標記未來機構間質框架的人類胚胎幹細胞的無序自發分化：體外有可能數以百萬計的肝細胞的形成，但你不能得到肝臟任何領域，包括這樣的結構和功能元素，如鼻竇，狄氏和枯否細胞的空間。

據認為，胚胎幹細胞的多能性在胚胎發育完全實現，形成胚胎的組織和器官，而臍帶和胎盤衍生滋養。封閉在外殼trofektodermalnuyu ESK持續生成細胞克隆provisory由組合的mRNA散裝Nohteyaov地形矩陣，其中預先確定的空間佈置，形狀，尺寸，臨時和最終的器官細胞數量和實質組件在結構和功能單位實現開發計劃。在同一時間的ESC是唯一細胞類型，其中實現它們的電勢的分子機制完全從開發和能源服務公司的遺傳程序本身剝奪與其它細胞相互作用的可能性由於雙方受體感知和transsignalizatsii系統的堵塞解離。然而，充足的胚胎幹細胞的活化導致逐步部署胚胎程序結束分娩完全形成，並準備數十億細胞組成的有機體的生命宮外。在這短短的時間，但在錯誤的在提供細胞的重要功能，以及分子機制的細胞空間路徑必然出現難以想像的債務，控制其增殖，分化和專業化的程序。因此，在現代藥物基因組學分開考慮疾病分子器件，以及疾病的細胞編程。和大多數的目的是糾正的分化，增殖和器官的程序，以及器官和組織的再生名新藥物的作用。在通過胚胎幹細胞的成年生物變得能夠控制移植到腦，肝，脾，骨髓和人的其它器官幹細胞/祖細胞的行為以修復由於保存矩陣分化和專業化供體間充質細胞損壞的收件人實質器官。從本質上講，全能性計劃推出另一卵母細胞基因組水平，受精卵卵裂球和，但這些細胞尚無法克隆和傳代所必需的教學法實驗和實用中藥的需求數量。因此，ESC是含有胚胎的三維線性限制圖和專門的細胞系碼原腸胚形成過程中遺傳信息的唯一來源。

再生ESC由於這樣的事實，它們的基因組中，與分化的體細胞的遺傳裝置，保持多能性幾乎無限的可能性。植根於胚胎幹細胞遺傳信息的休眠狀態的一個表現是所謂的最低表型 - 表達受體的數量有限的ESC的表面上，因此部署了很少程序進行交互與它的小環境細胞transsignalizatsii核設備。針對負責的專門的細胞系和細胞分化的限制休眠基因的背景下，激活僅約30 500個基因，其產物提供與周圍的微環境通信小區。使用示出的基因表達的系列分析的方法，該方法的主要功能基因組盒調節在受體，G-蛋白，第二信使，酶的mRNA的最後確定的極低量的體細胞和胚胎幹細胞能量代謝的一般性，輔因子的表達和抑制也就是說，整個系統跨膜調節信號到細胞中。這是由於transsanalization基因缺乏或非常低的表達。期間在ESC 18的操作的基因組中誘導分化停止同步運轉基因背景活化transsignalizatsii 61基因控制細胞粘附受體，細胞外基質組分的合成，限制性酶messendzhernyh元件和信號傳輸系統，用於與等離子體細胞膜受體核單元。同時阻斷負責蛋白質沉默的合成基因的表達，以及基因表達koingibitorov提供全能性基因組的hESC。

遺傳標記被發現為所有三個胚胎小葉的細胞。上的基因的表達所攜帶的標識外胚層細胞層節點，OCT3和FGF-5，中胚層細胞 - 基因的brachyury，ζ電珠蛋白，內胚層 - 在GATA-4基因的表達。在正常的胚胎發生，原腸胚形成過程中觀察到幹細胞和祖細胞的未成熟的群體的活性遷移，局部地指定所述顱骨的面部骨骼的區域，這是從克隆形成的腦，外週神經系統，心臟傳導系統和胸腺組織的某些部分移動的細胞。細胞標記早期基因胚層使得它更容易在發育中的胚胎祖細胞的遷移的地形分析。它尤其發現，在所述第一基因中胚層的brachyury的聚集體embryocarcinoma P19表達的細胞組織型纖溶酶原激活劑，α-胎蛋白，角蛋白8，和角蛋白19，其是早期中胚層遷徙群體的標誌物的基因表達的還原過程中開始。因此，中胚層起源的組織的形成僅遷移和穩定點的中胚層祖細胞的過程之後開始。

用極其有限的表型特徵和缺乏最transsignalizatsii ESC不過表達可用於識別它們的一些受體分子的塊。值得注意的是，發現人類和靈長類動物中的ESC抗原標記是常見的。最常用於標記的抗體對抗原的標記的hESCs membrannosvyazannym SSEA-3，SSEA-4（表示與唾液酸醣脂複合物獨特GL7脂質抗原），以及高分子糖蛋白TRA-1-81，TRA-1-60。此外，ESCs表達特定的胚胎SSEA-1抗原和內源鹼性磷酸酶，以及特定的Oct4轉錄因子。後者需要用於維持的hESC增殖機制 - 特異性轉錄因子Oct4基因激活成纖維細胞生長因子4基因表達的表達和穩定拳擊負責非限制性未成熟細胞DNA加倍。最重要的細胞內標記蛋白的Oct3，OCT4，萬億立方英尺和格勞喬，與染色質沉默的蛋白質。

長期培養的胚胎幹細胞的嘗試後幾乎立即不成功並且首次由從小鼠胚泡，和主要胚細胞培養物分離幹細胞的培養物製備的生物體，當在胚胎發育的早期階段施用開始階段ESC多能性的能力的研究。結果表明，在桑椹胚和胚泡的PGC能夠形成其中在所有體細胞組織，甚至在檢測到配子供體的PGC後代嵌合胚胎。因此，在使用ESC腳本“橋”，在體內和體外實驗研究，其中顯著增加研究流程書籤主組織和器官，它們的分化和胚胎器官的可能性之間發育生物學。

這是公認的，在胚胎發育過程中體內ESK融入早期胚胎細胞質量，以及它們的衍生物中的所有器官和組織中發現的。ESCs在嵌合胚胎中定殖一系列性細胞，後者形成完整的胚珠和精子。胚胎幹細胞是產克隆 - 單的PGC可以創建遺傳上相同分子標記，其包括OCT4基因表達和鹼性磷酸酶，高端粒酶活性，以及特異性胚胎抗原的表達細胞的集落。

通過創建一個生物結構，它位於外層四倍體卵裂球受體和供體的PGC研究胚胎發生的人類胚胎幹細胞使用嵌合桑椹胚的技術的機制施用到。因此，從形成的後代滋養四倍體卵裂球收件人，使植入和胎盤，並作為內細胞團，從所述主體和祖配子的一個可行的生殖系形成供體的PGC。研究ESC價值在於，不僅當與它們的基因組體外操縱保持多能性，而且在事實上，雖然節約參與形成嵌合胚胎的胚胎幹細胞的原始生殖細胞的能力。結果表明，僅一個基因修飾的PGC的後代所有定殖初級和細菌形成由聚集或細胞共培養8細胞胚胎獲得織物嵌合胚胎。當移植到綠色熒光蛋白基因轉染小鼠胚胎幹細胞桑葚胚，在胚胎發育（島田，1999年）的所有調查的組織中發現了細胞的熒光後代。將ESC移植到桑ula胚中可以建立有活力的小鼠，其體內僅由供體ESC的後代組成，這為開展治療性克隆的各種選擇打開了前景。現在，這種方法成功地用於研究發育生物學的問題，特別是分析了X染色體的遺傳失活或ESC的表觀遺傳不穩定性的機制。ESC在早期胚胎中的移植也用於農業生物技術以及基因治療實驗。

使用基因修飾的ESC的移植物來測試突變基因的靶細胞。體外培養的ESC在生物技術中用於創建基因敲除小鼠。為了這個目的，通過同源重組，以從胚胎幹細胞研究基因（敲除）被移除和選擇性培養基分泌缺乏這種基因的細胞。然後將敲除胚胎幹細胞注入胚泡或與桑blast胚球體聚集。將這樣得到的嵌合體早期胚胎移植到雌性受體和選擇具有配子，該基因的nullizigotnymi個體間新生小鼠。利用這項技術，已經開發出許多種基因敲除小鼠，這些小鼠已廣泛用於實驗生物學和實驗醫學。在這些生物模型研究了胚胎發育的某些基因的價值，以及它們在疾病和人類病理條件下的機制的作用。此外，基因治療新方法的臨床前測試階段使用基因敲除動物線。例如，使用在突變基因的ESK正常等位基因的基因轉染有效管理校正突變，撞擊造血系統。將外源基因導入ESC允許以加速的速度產生純合轉基因實驗動物系。但是，應該指出的是，該技術針對重組基因缺失可靠地制定出，但只有相對ESC小鼠。使用鼠胚胎幹細胞雙敲除安裝在7號染色體（拷貝基因組區域19分鐘人染色體）基因的功能性作用區域簇，第11號染色體的近側部分（複製人類染色體5D） - 在這些基因的缺失允許ESK小鼠評估其類似物在人類中的功能。

在胚胎眼 - 人類胚胎基因，轉基因，其實驗動物允許在特定的加密人類胚胎幹細胞澄清選項卡中的基因的作用，並形成心源性中胚層，PAX-6基因的能力功能研究。構成基因在未成熟的增殖卡ESC畸胎所述第一表達和囊胚小鼠證實在ESK transsignalizatsii基因壓倒性壓制。突變體ESC 60-80和正常的胚胎植入前小鼠胚胎的20-30細胞的結合導致嵌合體胚胎的發育中加入書籤的身體是由供體和受體細胞，這使我們能夠確定在原腸胚形成和器官未知基因的作用。的基因SF-1標籤的腎上腺和生殖器原基的作用的基因發育中的小鼠胚胎中放大細節的功能圖，WT-1基因 - 在腎臟標籤MyoD家族基因 - 骨骼肌基因家族的轉錄因子GATA-1-4的標籤 - 在限制成熟紅細胞和淋巴細胞生成的基礎。

導演關在使用矢量重組人類胚胎幹細胞的基因的母本和父本等位基因的服務在早期胚胎發育和技術定位，在小鼠胚胎幹細胞的人類未知的基因有助於引起嚴重遺傳性疾病的發展新的突變基因的發現闡明各種基因的功能。使用基因敲除方法中定義的一些基因的專性意義鋪設胚胎組織：GATA-4 - 為梗死，GATA-1 - 至紅系造血組織，MyoD的 - 骨骼肌，短尾 - 中胚層限制酶HNF3和HNF4 - 為肝幹細胞，RAG-2 - 書籤對於T的克隆和B淋巴細胞（列賓，2001）。在人類胚胎幹細胞基因的雙缺失已開通給予獲得可行的種間雜交胚胎的可能性生髮層，分割和同源異形和ESC移植的基因的功能作用的研究訪問。隨著一個8細胞胚胎的供體的PGC移植的改進方法證明，在嵌合收件人胚胎的許多器官的細胞水平。需要注意的是豆芽細胞在人體組織受體小鼠器官中發現的人類造血幹細胞的給藥後成胚泡。結果發現，在小鼠胚胎血液循環體多能胚胎幹細胞的形成過程中。它們的生物學功能可能是未來免疫系統的胚胎組織。與ESC體外再現人類遺傳疾病的足夠的模型：在杜興氏肌營養不良，關機ATM基因（控制信號合成激酶染色質）的小鼠雙敲除模型肌營養不良蛋白基因 - 共濟失調teleangektaziyu。在這種情況下，由於在DNA修復缺陷的致死性遺傳病的兒童發展浦肯野細胞中的小腦，這伴隨著胸腺對合的變性，由於增殖細胞的死亡。通過引入從小鼠嵌合體的ESC異常遺傳信息再現診所，病理生理學和patomorfologija共濟失調teleangek- tazii對應於那些用於人的。此外使用PGC和基因敲除小鼠共濟失調teleangektazii開發實驗模型，與碳水化合物和脂質代謝，氨基酸的分解代謝，去除銅和膽紅素，其顯著增加實驗醫學的可能性的新的方法的臨床前試驗用於治療相關疾病的病症相關的一些遺傳純合的人的疾病人。

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使用乾細胞cytohybrid

通過從hESC融合的體細胞得到的雜交細胞，是研究幹細胞多能性和分化的細胞的染色體的適當的重編程和有希望的模型。通過ESC的合併與成年動物的分化的細胞Tsitogibridy得到，提供了一個機會來研究不同的“年齡”的基因組之間的關係：開發了獨特的情況，其中同源染色體從分化的不同階段的細胞衍生的，以及不同程度的成熟的，在相同的細胞核，在那裡它們可以很容易地transdeystvuyuschimi共享調控信號，這是很難預測會如何反應，同源染色體的tsisregulyatornye後生系統YN期間存在 靈敏度獨立開發，響應於來自胚胎相關的基因組的影響transdeystvuyuschih信號。此外，在混合單元中發生親本染色體的分離，允許研究在分開的染色體水平的基因組的相互作用，即，潛在地識別特定染色體的部分在維持多能性的，或相反，在分化的產出。

作為研究不同的“發展史”的基因之間的相互作用的第一個實驗模型中使用tsitogibridy通過合併teratokartsinomnyh多能性和分化的體細胞中獲得。在一些情況下，這種雜交細胞在足夠高的水平下保留了多能性。特別是，在體內體細胞雜種teratokartsinomno細胞被誘導形成含胚狀體的所有三個胚層中，在體外在懸浮培養物的衍生物真畸胎瘤發展。即使在這種類型的種間細胞雜交種中，在與畸胎癌細胞融合的體細胞配偶體具有淋巴細胞或胸腺細胞的情況下也注意到了胚胎抗原。值得注意的是，由畸胎癌細胞與成纖維細胞融合產生的細胞雜交體根據表型對應於成纖維細胞。

最重要的是一個既定的事實，teratokartsinomno體細胞雜種細胞出現的跡象分化的細胞，其特點是單個基因或失活X染色體的體合作夥伴的激活的基因組重新編程。因此，對類型tsitogibridah teratokartsinomno，體細胞的研究結果表明，雜交細胞往往保留了基因組的多能性和重編程，有軀體夥伴的跡象。

在實驗中通過與小鼠ESC成年動物的脾細胞融合獲得胚胎種內雜交細胞研究了特性，例如tsitogibridov，親本染色體的分離分析和評估的多能性雜合基因組。對於由融合畸胎瘤細胞與體細胞產生的種間雜種細胞，通常其特徵在於通過與四倍體或近四倍體核型染色體的低偏析。通過原代性細胞與淋巴細胞的融合在細胞雜交中觀察到類似的染色體組成。與此同時，如小鼠淋巴細胞teratokartsinomnyh貂的合併的結果而獲得的種間雜種細胞，有染色體的強烈偏析體夥伴。

在種間雜種親本染色體的偏析的研究新的質量階段使用聚合酶鍊式反應，由此每個小鼠染色體中發現幾百標記微衛星分析方法的開發後，來到，允許在所述混合細胞的任何一對同源染色體之間可靠地辨別。

通過合併ESK（使用HM-1細胞在gipoksantinfosforiboziltransferazy活性缺陷，為2n = 40，XY，從囊胚小鼠品系129 / 01A隔離）與來自小鼠同類系DD / C的脾細胞未能接收到組雜交克隆的形態有相似的hESC。對所有克隆進行分離選擇性培養基，其中增長是可能只與活性細胞gipoksantinfosforiboziltransferazoy上。電泳分析表明所有克隆等位變體gipoksantinfosforiboziltransferazy特性小鼠DD / C的存在。使用細胞遺傳學分析，發現四個有三個雜種無性okolodiploidny組染色體。一個近四倍體克隆含有雜交細胞的兩個群體，其中之一是四倍體，和第二較小 - 二倍體。

微允許辨別任何一對同源染色體小鼠129 / 01A和DD / C的分析，與okolodiploidnym組雜交克隆表明，克隆發生在兩個不同的優先消除常染色體的體細胞夥伴。大多數的常染色體克隆HESS2和HESS3有標記線129 / 01A，即多能的合作夥伴。唯一的例外是在染色體1和I：克隆HESS2和HESS3，用HM-1細胞，少數標記物本體伴侶的標記一起。這些結果可能反映了染色體1的不完全隔離和和體細胞夥伴，並且與細胞遺傳學數據一致，即染色體三體性發生在30-40％HESS2和HESS3細胞克隆。HESS4克隆差異顯著在染色體組成：許多常染色體該克隆源於基因組ESK（染色體2，3，4，5，6，7，10，13，14和17），但染色體1，9，11，12， 15,16,18和19由雙親的同系物代表。標記這些同源染色體的微衛星的數量比大致對應於1：1。這使作者認為，一個同源從ESC和其他基因組的 - 從分化細胞。在克隆的一些亞克隆HESS4僅觀察到染色體18和19的體夥伴的令牌存在。結果表明，該細胞克隆HESS4，除了染色體的分離體的合作夥伴，有一個消除或以上染色體多能基因組的兩個同系物，即有父母雙方的染色體的雙面隔離 - 該現象是相當不尋常的，因為染色體tsitogibridov特徵偏析只父母之一。

此外，第20代後，雜交細胞的所有克隆僅包含軀體夥伴的X染色體標記，就是在克隆中的體細胞夥伴的X染色體上更換X染色體ESC。這通過使用特異於小鼠X-染色體的FITC標記的探針的原位雜交數據證實：僅在一條染色體上檢測到陽性信號。應該注意的是，在培養的早期階段（直至第15代），根據細胞遺傳學數據，在許多細胞中存在兩條X染色體。因此，使用選擇性培養基可以操縱雜交細胞的染色體組成並選擇性靶向攜帶ESC基因組背景的體細胞夥伴單染色體的克隆。

作為基因組tsitogibridov的一個獨特的特徵是親本的基因組在一個單一的芯的定位，當然，引發保持與分化細胞的基因組中緊密接觸的條件下多能胚胎基因組ESC-體細胞雜交體的性質的問題。形態學上，ESC和體細胞的細胞混合物類似於ESC的親本細胞系。資格多能性表明，所有克隆okolodiploidnym設置的染色體能夠形成在胚狀體的懸浮培養物，其中所述三個胚層的衍生物存在。

大多數雜交細胞含有ECMA-7抗原，這是早期小鼠胚胎的特徵性標記，並且還具有高鹼性磷酸酶活性。在實驗中獲得關於雜交細胞的高多能性的最令人信服的數據，以獲得涉及克隆HESS2的雜交細胞的一系列注射嵌合體。生化標誌物的分析顯示在大多數嵌合體組織中發現了供體雜交細胞的後代。因此，通過融合ESC和體細胞分化細胞獲得的雜交細胞保持高水平的多能性，包括插入胚泡腔時形成嵌合體的能力。

克隆HESS2和HESS4在親代染色體組成上差異顯著，但它們具有相似的多能特性。人們會認為在混合基因組plyuripotentnostv“表現為顯性標誌，但它有可能不是所有的胚胎基因組染色體參與了多能性維持的。如果這個假設是正確的，人們可以預期從雜交瘤基因組中消除多能配偶體的一些染色體不會伴隨其多能狀態的改變。在這種情況下，分析胚胎雜交細胞中親本染色體的分離將允許接近確定負責控制胚胎細胞多能性的染色體。

O. Serov和合著者（2001）在通過嵌合體與正常小鼠雜交獲得的50個後代中沒有發現，例如具有小鼠129 / 01a的基因型並攜帶DD小鼠的X染色體。作者在體細胞基因組的影響下看到了在雜交細胞中降低多能性的原因。另一種解釋可能是三體性的對常染色體和性染色體的一些不平衡的負面影響（XXY在細胞中觀察到最多第15通道）在混合的細胞在減數分裂的通道。已知XXY細胞不能通過減數分裂並形成配子。三體法還能夠引起雜交細胞增殖活性的降低，其結果是嵌合體發育的選擇性優勢可以屬於受體胚胎的細胞。因此，為了充分評估雜交細胞的多能潛力，有必要獲得具有正常二倍體染色體組的雜種克隆。

在實驗Serova O.等人（2001）首次證明在體細胞雜交細胞的基因組重新編程X染色體的可能性。這一結論如下從作者分析嵌合體的HPRT基因（X染色體標記物）的表達：等位基因的存在變體的嵌合分析所有組織中檢測到HPRT DD / c小鼠。應當強調的是，引入囊胚腔雜交細胞tsitogibridy落入非選擇性條件，並在雜交細胞的基因組中的X染色體的保存後意味著它已經成為其基因組中的專性組分和不從Y染色體的多潛能夥伴區分它。

總結雜交胚胎細胞中體細胞和多能基因組相互作用的分析結果，作者得出結論：在一些細胞雜交體中，多能性表現為一種顯性特徵。雜種基因組能夠重新編程分化細胞的單個染色體，然而，這並不排除體細胞基因組對胚胎基因組多能性的反向作用的可能性。在雜交細胞的培養中，分化的誘導比ESC NM-1的原始親本系更頻繁地發生。在初級菌落的形成中觀察到類似的效果：胚胎雜交細胞的許多初級菌落在形成的早期階段分化，其選擇和增殖期間克隆的大量損失。

因此，儘管與分化細胞的基因組密切接觸，但由胚胎幹細胞與體細胞融合而產生的細胞增生將多能性保持為胚胎基因組的獨特性質。而且，在這樣的雜交細胞中，可以重編程源自擴散細胞的單個染色體。目前尚不清楚雜交細胞中胚胎基因組的多能特性是否充分存在，特別是它們參與嵌合體中胚胎途徑形成的能力。為此，有必要獲得具有正常核型的胚胎雜交細胞。在任何情況下，多能胚胎雜交細胞可以成為確定涉及維持多能性或其控制的染色體的真實遺傳模型，因為親本染色體的雙側分離可能提供這樣的機會。

O. Serov和合著者（2001）將這一現象的研究定義為“染色體記憶”，這種吸引力不亞於此。在雜合基因組同源染色體兩種可選配置：同源體的合作夥伴曾經經過分化，而多能同源的合作夥伴，這個過程才剛剛開始。因此，保持雜交細胞的多能性高的屬性表示“多能性”構同源物ESC混合基因組相當穩定，儘管從軀體發出的夥伴transdeystvuyuschih因素的影響。重編程分化的同源基因組染色體的嵌合體的發育過程中的上述特徵不排除這樣的可能性形成在體外和培養tsitogibridov的第一階段它們保留在體內分化期間獲得的它們的狀態。根據最近的數據，在非選擇性培養基轉移胚胎雜交細胞時，其中存在是一個密集僅消除染色體的體夥伴，即，雜交細胞的基因組中容易判別在體外培養後的同系物10-15通道。因此，胚胎雜交細胞代表了一個有前途的實驗模型，不僅可以研究胚胎基因組的多能性基本特性，而且還可以研究其替代方法 - 胚胎分化。

胚胎幹細胞移植的治療效果

在分析ESC移植及其衍生物的治療效果之前，我們總結了上述材料。設有ESC在體外充分執行胚胎發生的條件是因為在這種情況下，由於不存在其中從hESC自主地並且獨立地發生在身體間充質幹細胞的缺陷不足。ESC的基因效力低於合子的遺傳潛力，因此它不直接用於克隆胚胎。在基因功能研究中發現了ESC作為開發計劃全部部署的唯一細胞的獨特生物學潛力。在ESC的幫助下，第一組激活早期和晚期基因表達的信號組合被破譯。體外胚胎幹細胞維持基因組的多能性使其成為修復再生，可自動補償受損的器官和組織的細胞損失的唯一工具。在一個理想的假想實施例可以假設“...在供體的PGC在受體生物體移植轉移其有利條件下在新tkani'7的結構能夠被實現緊湊地封裝程序”...有效地整合到受體的身體形態，功能和功能。“

自然，隨著ESC的單分化方法的發展，從單一特化克隆體外獲得的細胞的功能活性的體內研究開始。增殖ESO克隆產生遷移祖細胞群體，其真正能夠積極地整合到用於再生塑料醫學的受體組織損傷區中。已經證實，多巴神經元在黑質中的移植減少了實驗性偏側帕金森病的臨床表現。供體神經乾細胞的區域移植減少由創傷或脊髓和大腦挫傷引起的運動障礙的程度。收到和乾細胞移植脫髓鞘疾病的首例陽性結果。似乎ESCs的再生塑料效能為在實際醫學中使用細胞移植開闢了無限的可能性。但是，當移植到異位區時，ESCs不可避免地轉化為腫瘤。當皮下注射ESC在免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成時。當將ESK懸液移植到同基因小鼠的睾丸膠囊下時，也會形成畸胎瘤，由不同的組織組成，其細胞來自所有三個胚胎小葉。在這種畸胎瘤中，減少器官形成的過程極為罕見。

一些作品提供了有關將ESCO的早期衍生物移植到具有實驗病理學的動物的積極結果的信息。使用PGC的衍生物的細胞neurotransplantation在實驗中以及在腦和脊髓創傷，脊髓空洞症治療和多發性硬化（列賓，2001）的功能性障礙的補正的第一期臨床試驗被進一步發展。用體外技術neyronogeneza胚胎幹細胞的出現，而不是使用開發神經球的衍生物，從胚胎神經組織的培養物中獲得胚胎腦組織移植技術。這種移植混懸液更加均勻並含有定向的神經元和神經膠質前體。

除了與視黃酸的常規培養基在用於胚胎線（畸胎瘤）6週劑量為10微克/毫升NTERA-2人-kartsinomy形成超過80％的有絲分裂後神經元。該神經元群的完全同質性是通過流動實現分選成熟的神經元，可以擺脫殘餘的teratokartsinomnyh和幼稚細胞的免疫表標記標記。在移植到實驗動物大腦的各個區域之後，這些神經元不僅存活，而且還建立在區域神經網絡中。在動物的局部缺陷的實驗模型中CNS neurotransplantation降低人體病理學的臨床表現如顱腦創傷，中風，脫髓鞘疾病，遺傳性小腦發育缺陷，脂質和多醣的疾病沉積的影響。

為了優化中樞神經系統退行性疾病的再生過程，正在開髮用於從ESK製備產髓磷脂少突膠質細胞的技術。傳統上，第一階段涉及胚胎幹細胞的增殖以及移植所需的細胞數量的增加。在第二階段，將細胞定向分化為產生髓磷脂的少突膠質細胞前體群，其由選擇性標記抗原控制。

一些前景在打開使用胚胎幹細胞衍生物開發用於在胸腺的成熟由遺傳缺陷引起免疫缺陷的校正方法。與誘導的基因缺陷在敲除研究（抹布1）小鼠 - 違反重組機制V（d）J基因座TCR，導致功能喪失T淋巴細胞，在胸腺動物PGC的移植早期衍生物恢復負責免疫克隆的正常人群的成熟細胞免疫。體外胚胎幹細胞移植預製的臨床試驗治療遺傳性致命性貧血的兒童。

對於將乾細胞移植快速引入臨床的反對意見是由於有限數量的穩定的人胚胎幹細胞系及其標準化需求。為了提高標準化ESC係以及成體幹細胞的純度，建議了一種基於DNA短串聯重複的分子遺傳分析的系選擇方法。還有必要測試ESC系中是否存在小染色體重排和基因突變，它們在細胞培養條件下發生的潛在可能性足夠高。論文延伸強制檢測所有類型的PGC和區域的多能幹細胞的特性，因為它們的體外繁殖可產生在胚胎幹細胞向定形或組織不固有新的特點。特別地，假定長期培養在培養基中細胞因子赫斯接近腫瘤細胞，因為它們會發生類似的變化途徑調控細胞週期與採集的實現細胞分裂無限數量的能力。一些作者基於潛在的腫瘤發展，認為胚胎幹細胞的早期衍生物的人類移植是魯莽的。他們認為，使用ESC的承諾後代，即分化細胞的祖先線是安全的。然而，用於獲得穩定的人類細胞系的可靠技術在正確的方向上有所區別尚未開發。

因此，在文獻中關於人胚胎幹細胞衍生物移植的積極治療效果的數據越來越多。但是，這些作品中的很多都會受到修改和批評。一些研究人員認為，早期臨床試驗的結果本質上是初步的，並且只提示幹細胞可以對疾病的臨床過程產生有益的影響。因此，有必要獲得關於細胞移植長期結果的數據。作為論點，給出了臨床神經移植學發展的階段。事實上，在文獻中，最初是由在帕金森氏病的胚胎的腦部移植片段的高效率的出版物為主，但隨後開始出現報告否定移植到患者腦內胚胎或胎兒神經組織的治療功效。

進行了第一次臨床試驗評估移植的成神經細胞的安全性 - 的PGC NTERA-2的畸胎瘤衍生物，其在增殖培養未成熟的細胞進行存儲100百萬分之一的細胞團。由此獲得的細胞的部分被用來確定細胞表型和雜質的特性，以及由病毒和細菌來測試潛在的污染。從培養基中除去LIF和基質細胞和人類胚胎幹細胞用於定向分化成神經細胞成與細胞因子和生長因子的組合胎創造了條件的飼養層。然後，在流籠式分選機上從未成熟的畸胎癌細胞純化成神經細胞。移植細胞的神經母細胞的表型的第二純化和表徵後（10-12百萬），使用一種特殊的注射器和microcannulas立體定向和CT的控制下，懸浮液注射到患者的腦（出血性卒中後的第七個月）的基底核。移植後1年篩查中風區神經元移植效果顯示無副作用和不良影響。一半的患者在移植後6-12個月內的運動功能改善。積極的臨床變化是伴隨著細胞的移植後增加血液供給行程區：熒光標記的2-脫氧葡萄糖的平均吸附增加，根據正電子發射斷層達到18％，而在一些患者 - 35％。

然而，美國國立衛生研究院進行了一項關於帕金森綜合徵患者神經移植臨床療效的獨立研究。第一組的患者移植了產生多巴胺的胚胎神經組織，而第二組患者正在進行假性手術。結果表明這種神經移植的臨床效果為零，儘管多巴胺產生的胚胎神經元在接受者的大腦中存活。此外，2年後15％的患者胎兒神經組織移植後發生持久的運動障礙，它是在安慰劑組無（幹細胞：科學進展和未來的研究方向納特研究所，衛生美國......）。對這些患者進一步發展的觀察仍在繼續。

一些作者屬性上的臨床療效Neurotransplantation數據的評估的矛盾文獻用不同的方法對患者群體，用於評估他們的情況客觀的方法的選擇不充分的選擇，而最重要的是，在從該織物在不同的尺寸產生的大腦的不同部位的胎兒神經組織的和發展的不同方面移植和手術的方法特點。

應當指出的是，試圖引導多能胚胎幹細胞移植大鼠實驗體gemiparkinsonizmom的大腦紋狀體區域伴隨ESC增殖並分化為多巴胺能神經元。必須假定如移植後的胚胎幹細胞中觀察到的行為和運動不對稱的異常的校正在阿樸嗎啡試驗，該新形成的神經元有效地內置到神經元網絡中。同時，一些動物由於移植的ESK在腦腫瘤中的轉化而死亡。

美國國家和醫學科學院的專家，美國國立衛生研究院的專家認為，人類胚胎幹細胞的臨床應用前景值得認真關注，然而，堅持需要它們的性質進行了詳細研究，在人類疾病的足夠的生物模型的實驗並發症和長期影響的可能性（幹細胞和未來的再生醫學國家學院出版社，幹細胞和未來的研究方向，美國國立衛生研究院）。

從這個觀點來看，重要的是通過在移植睾丸漿料的PGC與已經開發由於移植早期胚胎畸胎瘤，其中包括所獲得的實驗畸胎瘤的組織學比較分析也存在ESC表明ESK不論其來源或相互作用的由那些或其他周圍細胞以相同方式實現其致瘤能力。它證明，這種畸胎瘤具有克隆起源，如從腫瘤胚胎幹細胞可能會發生，由所有三個胚層（.Rega，2001）的衍生物。值得注意的是，當移植到克隆與正常核型和組成的多種類型的分化的體細胞形成畸胎瘤的PGC免疫缺陷小鼠。這些實驗數據是畸胎克隆起源的完美證明。從發育生物學的角度來看，他們表明，它是不定向祖細胞和多能幹細胞標識中的多個是所有三個胚層的分化衍生物，畸胎瘤組件的源。然而，在這些研究的實際細胞移植的結果，如果不是望而卻步，那麼潛在的危險警告標誌，因為接種ESC或成人免疫缺陷小鼠的不同組織的原始生殖細胞不可避免地導致從移植的幹細胞腫瘤的發展。腫瘤退化異位移植ESC伴隨著分化的細胞群的衛星的出現 - 通過部分地分化為胚胎幹細胞肯定和祖克隆專用線路。有趣的是，當將ESC移植到畸胎癌細胞旁邊的骨骼肌時，神經元最常形成。然而，將ESC引入破碎的卵子或胚泡中伴隨著細胞完全整合入胚胎而不形成瘤形成元素。在這種情況下，胚胎幹細胞幾乎建立在胚胎的所有器官和組織中，包括性遺傳。首先通過將畸胎癌細胞129導入8-100細胞階段的早期胚胎中來獲得這種異種動物。在allofennyh小鼠種群geterogenomnyh細胞衍生捐助的PGC引入骨髓，腸，皮膚，肝臟和生殖器，它允許你在實驗中甚至異種細胞嵌合體創建。早期胚胎的時間越少，細胞嵌合，造血系統觀察到的最高程度的嵌合，皮膚，中樞神經系統，肝臟和小腸allofennogo胚胎的百分比越高。在伴隨著供體幹細胞的插入受體組織germenativny層睾丸實質移植原始生殖細胞：在成年生物體組織順從嵌合保護免於暴露到的接收者gistogematicalkie障礙免疫系統。然而，隨著ESC移植入囊胚，生殖器官嵌合基因的形成與供體原代有性細胞的產生不會發生。創建特殊條件，並且可以用於克隆時ESC的多能性：ESC移植小鼠8-16細胞小鼠胚胎，細胞有絲分裂，其特徵在於tsitokalazinom受阻，有助於與胚胎供體PGC的發展正常胚胎發生。

因此，另一種方法是基於體細胞核移植入去核卵母創建胚泡內細胞團從其然後分配遺傳上相同的供體的PGC體細胞核的線同種異體ESC治療性克隆的移植。從技術上講，這種想法是可行的，因為創建的hESC細胞系的自體細胞核到實驗室動物實驗反复證明去核卵細胞的移植後獲得胚泡的可能性（納吉，1990; Munsie，2000）。特別地，在小鼠純合的突變RAG2，通過使用真皮下組織細胞作為供體核移植入去核卵母培養得到的成纖維細胞。活化後，卵母細胞“合子”培養直到胚泡形成，從內細胞團是分離的PGC和將它們傳遞到一個線對突變基因nullizigotnyh細胞（RAG2 - / - ）。通過在這些ESC中的同源重組，一個等位基因的突變得到糾正。在從hESC第一系列的實驗中重組基因回收製備胚狀體，轉染的細胞與它們的重組逆轉錄病毒（HoxB4i / GFP）和之後在小鼠中注射傳播靜脈RAG2 - / - 。在第二個系列中，四倍體卵裂球與基因修飾的胚胎幹細胞聚合併移植到它們的雌性受體中。所產生的免疫活性小鼠充當骨髓供體，用於移植至突變小鼠rag2 - / - 。在這兩個系列，結果為陽性：3-4週在正常成熟骨髓細胞和淋巴樣細胞的所有小鼠已被發現能生產免疫球蛋白。因此，移植入體細胞的卵母細胞的細胞核可以不僅用來產生hESC細胞系，也為tsitogenoterapii - 使用ESC作為用於校正遺傳信息的傳輸的載體遺傳異常的修正。但在細胞移植的這個方向上，除了生物倫理問題之外，還有其局限性。目前尚不清楚如何安全的移植將被克隆治療與細胞相同的特定患者的基因型基因型，因為這些細胞可以引入創建一個傾向某些疾病的突變。正常的人類卵子保持為不可訪問對象，移植體細胞核到去核卵母細胞動物只有15-25％的加工的“合子”發展到胚泡階段，而即便。目前還不確定需要多少胚泡來獲得一系列多能克隆胚胎幹細胞。應該指出的是，與治療性克隆方法的複雜性相關的高額財務費用。

總之，在該ESC多能性基因組低甲基化DNA與高端粒酶活性和短C 1-4細胞週期階段，這確保密集和潛在的無限繁殖，在此期間保持的PGC二倍體染色體和“少年”組的表型特徵組合。在文化的PGC的克隆生長不排除它們分化成機體的任何專門的細胞在停止線擴散並添加適當的調控信號。在體外體細胞系的人類胚胎幹細胞分化的限制而不間質的參與被實現，繞過Nohteyaov，是器官發生和無胚胎的形成。ESC在體內的異位施用不可避免地導致形成畸胎瘤。ESC移植入伴隨著他們與胚胎的組織和穩定的嵌合體整合胚泡或早期胚胎。

基於細胞移植和再生塑料技術是細胞生物學，發育生物學，實驗遺傳學，免疫學，神經病學，心血管，血液學和實驗和實際醫學的許多其他領域的成員的利益的交點。最重要的實驗結果證明與它們的性質，其用於控制與生長因子細胞分化過程開闢了前景的變化的方向重新編程幹細胞的可能性 - 對心肌再生，CNS損傷和胰腺的胰島裝置的功能正常化的恢復。然而，廣泛引入移植衍生物ESC在醫療實踐中有必要研究人類幹細胞的更詳細的的疾病的實驗模型的PGC的屬性和進一步的實驗。

生物倫理問題和排斥異體細胞移植的問題可以解決區域成體幹細胞的基因組中所觀察到的可塑性。然而，最初的信息是移栽的肝臟分離和充分表徵的自體造血幹細胞，其中有新肝細胞，摻入肝小葉時，目前正在審查和批評。然而，公佈的數據，在胸腺的神經幹細胞的移植是的供體T和B淋巴細胞的新芽的形成，和移植腦的神經幹細胞在骨髓中導致造血胚芽持續供體骨髓和紅細胞生成的形成。因此，在成體器官可以保存能夠ESC的基因組重編程能力的多能幹細胞。

胚胎幹細胞用於醫學用途的來源仍然是人類胚胎，其中預先確定的道德，倫理，道德，法律和宗教問題的新跨越的必然性，在人類生命的起源。胚胎幹細胞的發現為恢復關於活細胞與物質，物質和人格之間的界線的重新討論帶來了強有力的推動力。同時，儘管一再嘗試創建和接受ESC，但在ESC中沒有關於ESC在醫學領域的普遍規範，規則和法律。其立法中的每個州都自行解決這個問題。對於他們來說，來自世界各地的醫生繼續嘗試開發超出此類討論的再生塑料醫學，主要是通過使用非胚胎幹細胞和成體有機體的干細胞儲備。

胚胎幹細胞分離的一些歷史

Terato-（胚胎）細胞購自-kartsinomnye自發產生睾丸畸胎瘤小鼠品系129 /叔SV，自發卵巢畸胎瘤小鼠品系的Lt / SV，並從畸胎瘤，ektopichno源移植的細胞或胚胎組織分離。中由此獲得terato-穩定小鼠品系（胚胎）-kartsinomnyh一些細胞是多能，其他只在一個特定類型的細胞進行分化，有的已經通常不能細胞分化的。

當時，重點是研究，發現一個可能的返回terato-（胚胎）-kartsinomnyh細胞表型正常它們在發育中的胚胎組織的介紹，以及工作在體外轉基因terato-（胚胎）-kartsinomnyh創建細胞，獲得了用於人類遺傳病理學生物學建模的突變小鼠的幫助。

使用條件懸浮培養來分離畸胎 - 胚胎 - 癌細胞系。在培養terato-（胚胎）-kartsinomnye細胞，胚胎幹細胞一樣，生長以形成胚狀體，並需要被翻譯成一條線結合解離胚胎成纖維細胞或條件培養基中懸浮培養的飼養層上保持多能性。Terato-多能細胞（胚胎） - 癌細胞系大的，球形的，具有鹼性磷酸酶，形成聚集體的高活性，並能多向分化。當引入胚泡聚集與桑葚胚，導致嵌合體胚胎的形成，在該衍生物中發現terato-（胚胎）-kartsinomnyh細胞的各種器官和組織。然而，絕大多數這樣的嵌合體胚胎的死在子宮內，並在器官存活的嵌合體新生外來細胞，並用低密度幾乎檢測不到。與此同時腫瘤（纖維肉瘤，橫紋肌肉瘤，和其他類型的惡性腫和腺瘤胰腺）急劇增加，和腫瘤退化的發病率常常甚至在子宮內的嵌合體胚胎發生。

正常胚胎細胞微環境中的大部分畸胎瘤細胞幾乎自然獲得惡性腫瘤特徵。據認為，不可逆轉的惡性腫瘤是由於原癌基因在結構重排過程中的激活所致。一個例外是細胞系embriokartsinomnoy SST3，畸胎瘤來自鼠睾丸（線129 / SV之三），其表現出整合進入組織和胎兒器官，而不在嵌合體小鼠隨後形成腫瘤的能力高的。嵌合體小鼠中的畸胎 - 胚胎 - 癌細胞系的衍生物實際上不參與初級生殖細胞的形成。顯然，它與常見的大多數terato-（胚胎）染色體畸變，其中觀察到的非整倍體或染色體異常細胞-kartsinomnyh線的高頻連接。

在實驗室中，獲得了幾種人類畸胎瘤的穩定細胞系，其特徵在於多能性，高增殖活性和能夠與培養物中的生長分化。特別是使用人胚胎癌細胞系NTERA-2來研究神經細胞分化的機制。將該細胞移植到新生大鼠前腦室下區後，觀察其遷移和神經發生。已經有甚至試圖移植通過培養細胞（胚胎）-kartsinomnoy線NTERA-2中獲得的神經元terato-，給患者中風，其中，根據作者，導致臨床改善該疾病。在這種情況下，沒有註意到中風患者的畸胎 - 胚胎癌細胞系NTERA-2的移植細胞惡性腫瘤。

埃文斯和馬丁在20世紀80年代早期接受了來自小鼠的第一批未分化的多能胚胎幹細胞，將它們從胚泡的胚泡內細胞團中分離出來。分離的ESC係長時間保存的多能性和在特殊培養基因素影響下分化成不同類型細胞的能力。

術語“胚胎多能幹細胞”屬於樂華史蒂文斯是對腫瘤發展的頻率煙焦油的影響調查提請注意對照組的小鼠的線性自發睾丸畸胎瘤（129 / V）的發生。由高增殖速率睾丸畸胎瘤細胞進行表徵，並在保持與神經元細胞，角質細胞，軟骨細胞，心肌細胞自發分化，以及毛髮和骨碎片的形成腹腔液體的存在，但沒有一個有序cytoarchitectonics適當的組織的任何指示。當在畸胎瘤細胞培養物種植生長未附著到基底的多能克隆，然後將形成的胚狀體淬滅，並經受自發裂變無序分化成神經元，神經膠質，平滑肌細胞和心肌細胞。史蒂文斯發現，畸胎癌鼠標129 / v的含有能夠分化成各種專門的體細胞系的細胞的小於1％，和本身分化取決於影響他們的（組合物腹膜液，加入到成熟細胞或組織的培養物中的產物）的因素。樂華史蒂文森假設大約畸胎瘤細胞中存在胚胎祖性生殖細胞證實：在成年小鼠組織的懸浮液胚細胞植入前胚胎細胞形成的畸胎瘤，和腹膜內給藥後從它們的純細胞系中分離到受體動物已經分化成神經元，心肌細胞和其他體細胞kletki所有三個胚層的衍生物。在體內移植ESK實驗在不同的階段行器官嵌合動物（無腫瘤形成），其檢測豆芽供體組織的8-32卵裂球結束出生（從成胚得到，但不滋養層）在小鼠胚胎。觀察到即使是在生殖細胞的嵌合體線。

初級祖生殖細胞從小鼠胚胎生殖性，形態學，免疫表型和功能特徵與來自畸胎史蒂文森和胚細胞衍生的hESC一致隔離。在人類胚胎幹細胞的給藥後出生成胚泡嵌合體，allofenny器官形態特點鑲嵌交替的供體和受體的結構和肝，肺和腎的功能單元。在許多情況下，觀察到同時包含受體細胞和供體細胞的腸隱窩或肝小葉的形成。然而，根據受體所屬物種的遺傳程序，總是發生形態發生，嵌合體僅限於細胞水平。

然後，人們發現，人類胚胎幹細胞的無細胞分化在飼養層間充質細胞（胎兒成纖維細胞）的增殖發生在LIF在選擇性的營養培養基，其選擇性地提供幹細胞和祖細胞的僅存活結合的存在，而絕大多數的專門細胞元件的模具。隨著1998年這些技術由詹姆斯·湯姆森的幫助下被分配胚胎幹細胞五個永生線從胚泡人的內細胞團。同年，約翰·格哈特已發展成隔離的四五個星期的人類胚胎性粉撲不朽ESC線的方法。由於其獨特的性質，在短短兩年內，胚胎幹細胞和確定組織的干細胞已經開始用於再生醫學和基因治療的實踐。