间充质干细胞

在区域干细胞中，间充质干细胞（MSC）占据着特殊的地位，其衍生物构成了人体所有器官和组织的基质。MSC研究的优先权属于俄罗斯生物科学领域的代表。

上世纪中叶，A. Friedenstein 实验室首次分离出骨髓多能基质干细胞的均质培养物。附着在基质上的间充质干细胞长时间保持高增殖强度，在低接种密度培养中，固定在基质上后，它们形成了不具有吞噬活性的成纤维细胞样细胞克隆。MSC 增殖的停止终止于其在体外自发分化为骨、脂肪、软骨、肌肉或结缔组织细胞。进一步的研究使得确定各种哺乳动物骨髓基质成纤维细胞样细胞的成骨潜能及其集落形成活性成为可能。体内实验表明，集落形成成纤维细胞样细胞的异位和原位移植均导致骨、软骨、纤维和脂肪组织的形成。由于骨髓基质干细胞具有高度自我更新能力和在单个细胞系内多方面分化的能力，因此被称为多能间充质祖细胞。

值得注意的是，经过45年对间充质干细胞的基础研究，已经为其衍生物在临床实践中的应用创造了真正的条件。

如今，毫无疑问，人体所有组织均由各种细胞系的干细胞通过增殖、迁移、分化和成熟过程形成。然而，直到最近，人们才认为成体生物体的干细胞具有组织特异性，即只能在其所在组织中产生特化细胞系。造血干细胞不仅能转化为外周血细胞成分，还能转化为肝脏卵圆细胞，这一事实驳斥了这一观点。此外，神经干细胞已被证实能够分化为神经元和神经胶质细胞成分，以及早期定向造血祖细胞系。反过来，通常产生骨、软骨和脂肪组织细胞成分的间充质干细胞也能够转化为神经干细胞。人们认为，在生长、生理和修复性组织再生过程中，未定向的祖细胞是由组织非特异性干细胞储备产生的。例如，间充质干细胞从骨髓迁移到骨骼肌，可以实现肌肉组织的修复。

尽管并非所有研究人员都认可干细胞的这种交叉互换性，但间充质干细胞作为细胞移植来源和遗传信息细胞载体在临床应用的可能性已不再受到质疑，骨髓基质干细胞的多能性也同样如此，它可以相对容易地分离和体外培养扩增。与此同时，关于骨髓基质干细胞潜在多能性的报道不断出现在科学文献中。作为证据，引用了研究方案，其中在特定的转分化诱导剂的影响下，MSCs 转化为神经细胞、心肌细胞和肝细胞。然而，一些科学家对早期胚胎发生时期基因的重复激活和表达的可能性表示严重怀疑。同时，每个人都明白，如果找到将间充质干细胞的多能性扩展到胚胎干细胞的多能性的条件，再生整形医学中的许多伦理、道德、宗教和法律问题将自然而然地得到解决。此外，由于在这种情况下，再生干细胞潜能的来源变成了患者自体基质细胞，因此细胞移植的免疫排斥问题也得到了解决。不久的将来，我们将见证这些前景的现实性。

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间充质干细胞在医学中的应用

在临床上，间充质干细胞衍生物主要用于修复广泛深层热损伤引起的组织缺损。在临床前阶段，对使用同种异体成纤维细胞样间充质干细胞治疗深度烧伤的可行性进行了实验评估。结果表明，骨髓成纤维细胞样间充质干细胞在培养中可形成单层，这使得移植这些细胞以优化深度烧伤创面的再生过程成为可能。作者指出，胚胎成纤维细胞具有类似的特性，但其临床应用受到现有伦理和法律问题的限制。以Wistar大鼠为模型，建立了皮肤各层均受损的深度热烧伤模型。烧伤面积占皮肤总表面积的18%-20%。第一组实验大鼠为深度热烧伤大鼠，接受同种异体成纤维细胞样间充质干细胞移植。第二组实验大鼠为深度热烧伤大鼠，接受同种异体胚胎成纤维细胞移植。第三组为未接受细胞治疗的深度热烧伤对照组大鼠。用移液器将2 x 10 4 的成纤维细胞样间充质干细胞和胚胎成纤维细胞悬液滴加到烧伤创面^。在烧伤建模并切除坏死痂后第二天收集细胞。细胞移植后，用浸润有含庆大霉素的等渗氯化钠溶液的纱布巾覆盖烧伤表面。从成年 Wistar 大鼠的股骨中收集骨髓细胞以获取 MSCs，随后将其诱导成成纤维细胞样间充质干细胞系。从 14-17 天大的胚胎的肺中获得胚胎成纤维细胞。将用于获取 MSCs 的胚胎成纤维细胞和骨髓细胞在培养皿中预培养，培养箱温度为 37°C，CO2 浓度为 5%，湿度为 95%。胚胎成纤维细胞培养 4-6 天，而 MSCs 单层形成需要 14 至 17 天。随后，将MSCs冷冻保存，作为成纤维细胞样间充质干细胞的来源材料，这些细胞是通过解冻并培养4天获得的。形成的成纤维细胞样间充质干细胞的数量是同一培养期内形成的胚胎成纤维细胞数量的3倍以上。为了在培养阶段识别烧伤创面中的移植细胞，使用基于重组腺病毒V型的病毒穿梭载体标记其基因组，该载体携带编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的1ac-2基因。在移植后不同时间点的活细胞中，通过添加X-Gal底物的冷冻切片进行免疫组织化学检测，X-Gal底物可呈现特征性的蓝绿色染色。通过对烧伤创面状况进行动态视觉、平面和组织学评估，结果发现，在细胞移植后第3天，所选组的创面愈合过程已出现显著差异。这种差异在细胞移植后第 7 天变得尤为明显。第一组移植了成纤维细胞样间充质干细胞的动物，伤口呈现出均匀的深粉红色，肉芽组织在整个区域生长至表皮水平，烧伤面积明显缩小。伤口表面形成的胶原膜略微变薄，但仍然覆盖整个烧伤区域。第二组移植了胚胎成纤维细胞的动物，肉芽组织仅局部生长至伤口边缘的表皮水平，而伤口的浆溢比第一组更严重，最初形成的胶原膜几乎消失。未接受细胞治疗的动物在第 7 天的烧伤伤口呈苍白、凹陷的坏死组织，上面覆盖着纤维蛋白。整个烧伤表面均可见浆膜。组织学上，第一组和第二组动物的细胞浸润和血管网络发育减少，且第1组大鼠的这种早期再生过程的迹象更为明显。对照组大鼠创面可见细胞浸润的迹象，未见新生血管的组织学形态。在观察的第15～30天，第1组大鼠的烧伤面积明显小于其他组大鼠，且肉芽组织更发达。第2组大鼠的烧伤面积与对照组大鼠的烧伤创面相比也有所减小，这是由于边缘上皮化所致。对照组大鼠烧伤创面部分区域苍白，肉芽组织稀少，出现血管星状点，有纤维素性斑块小岛，整个烧伤表面持续有中度浆溢，部分区域残留难以分离的痂皮。总体而言，在第三组动物中，伤口的大小也有所减小，但伤口边缘仍然受到破坏。

因此，在使用成纤维细胞样间充质干细胞和胚胎成纤维细胞以及未使用细胞疗法的情况下对伤口愈合速度进行比较的研究中，发现移植成纤维细胞样间充质干细胞和胚胎成纤维细胞后烧伤表面的愈合速度有所加快。然而，在使用同种异体成纤维细胞样间充质干细胞的情况下，伤口愈合速度高于移植胚胎成纤维细胞的情况。这表现为再生过程阶段变化的加速——细胞浸润时间缩短，血管网络生长速度加快，以及肉芽组织形成加快。

动态面积测量结果显示烧伤创面自发愈合率（未使用细胞疗法）最低，移植同种异体成纤维细胞样间充质干细胞后第15天和第30天，创面愈合率高于移植胚胎成纤维细胞。β-半乳糖苷酶的组织化学检测方法显示，移植成纤维细胞样间充质干细胞和胚胎成纤维细胞后，移植细胞在整个观察期内均在再生创面的表面和深处保持活力。作者认为，使用成纤维细胞样间充质干细胞的烧伤创面再生率较高是由于这些细胞在成熟过程中释放了具有生物活性的生长刺激因子。

自体或异体角质形成细胞和异体成纤维细胞移植用于治疗烧伤创面也已在临床实践中得到应用。需要注意的是，儿童大面积深度烧伤的手术治疗是一项复杂的任务，因为烧伤创伤大、手术操作繁琐、失血量大以及患者对输注介质的反应各异。对于面积超过体表面积40%的大面积深度烧伤，进行皮肤整形手术的主要困难在于患者病情严重以及供体皮肤资源匮乏。使用穿孔系数高的网状移植并不能解决问题，因为穿孔后形成的细胞上皮化非常缓慢，皮瓣本身也经常裂解或干燥。异种皮肤、尸体同种异体移植、合成薄膜覆盖等烧伤创面覆盖材料并不总是有效，因此，正在开发用培养的角质形成细胞和成纤维细胞层覆盖烧伤表面的新方法。具体来说，已经提出了一种借助培养的同种异体成纤维细胞覆盖烧伤表面的方法，移植后，该方法对边缘烧伤伤口中保存的表皮细胞以及网状移植隔膜中的角质形成细胞的增殖有明显的刺激作用。L. Budkevich 等人的著作（2000 年）介绍了使用此方法治疗儿童烧伤的结果。该研究包括 31 名年龄从 1 岁到 14 岁的热伤儿童。三名儿童的 IIIA-B - IV 级烧伤伤口总面积为 40%，25 名儿童为 50-70%，另外三名儿童为 71-85%。早期手术坏死切除术与培养的同种异体成纤维细胞移植和自体皮成形术相结合。治疗的第一阶段包括切除坏死组织，第二阶段包括在载体膜上移植培养的异体成纤维细胞，第三阶段（移植培养的异体成纤维细胞 48 小时后）包括去除基质并用穿孔比为 1:4 的皮瓣进行自体皮瓣成形术。3 名因严重烧伤入院的患儿将培养的异体成纤维细胞移植到肉芽伤口。18 名患儿移植了一次培养的异体成纤维细胞，11 名患儿移植了两次，2 名患者移植了三次。细胞培养覆盖的伤口表面面积为 30 至 3500 cm2。通过皮肤移植的总植入率、烧伤愈合时间和严重热伤死亡人数来评估培养的异体成纤维细胞的有效性。86% 的患者移植皮片完全植入。14% 的病例出现皮肤移植部分未植入。尽管接受了治疗，仍有6名（19.3%）儿童死亡。他们的皮肤损伤总面积占体表面积的40%至70%。培养的同种异体成纤维细胞的移植与任何患者的烧伤死亡率均无关。

通过分析治疗结果，作者指出，以前覆盖 35-40% 体表面积的深度皮肤热损伤被认为是无法存活的（对于 3 岁以下儿童，覆盖 30% 体表面积的深度烧伤是危急的，对于年龄较大的儿童，覆盖 40% 以上的体表面积的深度烧伤是危急的）。当进行手术坏死切除术联合移植培养的异体成纤维细胞，随后用高穿孔系数的皮瓣进行自体皮瓣成形术时，IIIB - IV 度烧伤仍然危急，但目前在许多情况下，即使是这样的患者也有挽救生命的希望。对于深度烧伤儿童，手术坏死切除术联合移植培养的异体成纤维细胞和自体皮瓣成形术已被证明对于皮肤病变广泛且供区短缺的患者特别有效。积极的外科手术策略和移植培养的异体成纤维细胞有助于快速稳定烧伤患者的总体状况，减少烧伤感染并发症的发生，为移植皮瓣的植入创造有利条件，缩短皮肤缺损的修复时间和住院治疗时间，降低大面积烧伤患者的死亡概率。因此，移植培养的异体成纤维细胞并随后进行自体皮瓣移植术，可以使此前被认为无法治愈的重度烧伤儿童获得康复。

人们普遍认为，烧伤治疗的首要目标是最全面、最快速地修复受损皮肤，以预防毒性作用、感染性并发症和脱水。培养细胞的应用效果很大程度上取决于烧伤创面本身是否适合移植。在手术坏死切除术后将培养的角质形成细胞移植到创面的情况下，平均55%（按面积计算）的移植细胞会植入，而对于肉芽肿性创面，植入率则降至15%。因此，成功治疗大面积深度皮肤烧伤首先需要积极的手术策略。对于IIIB-IV度烧伤创面，应立即清除烧伤表面的坏死组织，以减少中毒并减少烧伤并发症。采用此类策略是缩短从烧伤到创面愈合的时间以及大面积烧伤患者住院时间的关键，同时也能显著减少死亡病例的数量。

20 世纪 80 年代初，首次出现了成功使用培养角质形成细胞覆盖烧伤表面的报道。随后，人们开始使用多层培养的角质形成细胞进行这一操作，这些细胞通常来自自体细胞，很少来自异体角质形成细胞。然而，自体角质形成细胞移植技术无法建立细胞库，而获得足够面积的角质形成细胞移植物所需的时间很长，长达 3-4 周。在此期间，发生感染和其他烧伤并发症的风险急剧增加，这显著延长了患者的总住院时间。此外，自体角质形成细胞移植到肉芽肿性烧伤创面后几乎无法生根，特殊生长培养基和角质形成细胞生长的生物活性刺激剂的高昂成本显著限制了其临床应用。其他生物技术方法，例如胶原成形术、冷冻保存异种皮肤移植以及各种生物聚合物涂层的使用，可以提高大面积浅表烧伤的治疗效果，但对深度烧伤无效。用培养成纤维细胞覆盖伤口表面的方法与此截然不同，因为培养细胞层的主要成分是成纤维细胞，而不是角质形成细胞。

开发该方法的前提是，围绕小血管的周细胞是祖间充质细胞，能够转化为成纤维细胞，而成纤维细胞会产生许多生长因子，并通过对角质形成细胞的增殖和粘附产生强大的刺激作用来确保伤口愈合。使用培养的成纤维细胞来闭合伤口表面立即显示出与使用培养的角质形成细胞相比该方法的许多显着优势。特别是，在培养中获得成纤维细胞不需要使用特殊的营养培养基和生长刺激剂，与获得角质形成细胞的成本相比，这将使移植成本降低 10 倍以上。成纤维细胞很容易钝化，在此过程中它们会部分失去表面组织相容性抗原，这反过来又为使用同种异体细胞制造移植物和建立其库提供了可能性。获得临床可用移植材料所需的时间从3周（角质形成细胞）缩短至1-2天（成纤维细胞）。通过培养自体皮肤移植术中取得的皮肤碎片中的细胞，可以获得原代成纤维细胞培养物，而获得人成纤维细胞亚培养物的细胞接种密度仅为每平方厘米^{20 x 103 个}。

为了研究成纤维细胞及其调控蛋白对角质形成细胞增殖和分化的影响，对角质形成细胞在I型和III型胶原蛋白以及纤连蛋白基质上与人成纤维细胞联合培养时的形态和增殖进行了比较分析。从烧伤患者自体植皮术中采集的皮肤碎片中分离人角质形成细胞。角质形成细胞接种密度为50 x 103个细胞/cm2。在517例患者中评估了培养成纤维细胞移植的临床效果。所有患者分为两组：第1组：IIA、B-IV度烧伤成人患者；第2组：IIIB-IV度深度烧伤儿童患者。通过评估单层培养成纤维细胞的结构和功能组织动态，同时考虑到糖胺聚糖、纤连蛋白和胶原蛋白在再生过程中的作用，作者确定第 3 天是使用成纤维细胞培养物进行移植的最佳时期。关于成纤维细胞对角质形成细胞增殖和分化影响的研究表明，体外成纤维细胞具有明显的刺激作用，主要对角质形成细胞粘附过程有刺激作用，可增加粘附细胞的数量和固定率 2 倍以上。粘附过程的刺激伴随着 DNA 合成强度和角质形成细胞增殖水平的增加。此外，结果表明，成纤维细胞及其形成的细胞外基质的存在是角质形成细胞张力原纤维器形成、细胞间连接以及最终角质形成细胞分化和基底膜形成的必要条件。在治疗深度烧伤患儿方面，同种异体成纤维细胞培养物移植已证实具有较高的临床疗效，尤其对于供区缺损且皮肤病变广泛的患者。全面的形态功能研究表明，移植的成纤维细胞能够活跃地合成DNA以及胶原蛋白、纤连蛋白和糖胺聚糖，而这些物质是细胞形成的细胞外基质的一部分。作者指出，移植的成纤维细胞的植入率很高（高达96%），接收时间也大大缩短（24-48小时内即可完成，而使用角质形成细胞则需2-3周），烧伤表面上皮的形成速度显著加快，而且与角质形成细胞移植相比，成纤维细胞移植技术的成本也显著降低（降低了10倍）。使用培养的同种异体成纤维细胞移植可以挽救严重烧伤儿童的生命——超过 50% 的身体表面受到热损伤，此前，烧伤被认为是与生命格格不入的。值得一提的是，通过移植同种异体胚胎成纤维细胞，不仅能够加快不同程度和面积烧伤患者的伤口再生和康复，而且死亡率也得到了令人信服的证明。

自体成纤维细胞也用于诸如声带损伤重建矫正等复杂的整形外科领域。通常使用牛胶原蛋白，但其作用时间受其免疫原性限制。作为一种外来蛋白质，牛胶原蛋白对受体的胶原酶敏感，并可能引起免疫反应。为了降低风险，人们开发了戊二醛交联胶原蛋白制剂技术。其优势在于稳定性更高、免疫原性更低，已在修复声带缺陷和萎缩方面得到实际应用。自体胶原蛋白注射于1995年首次使用。该技术能够保留自体胶原纤维的一级结构，包括分子内酶催化交联。事实上，天然胶原纤维比端肽被切断的重组胶原纤维更能抵抗蛋白酶的破坏。端肽的完整性对于胶原纤维的四级结构和相邻胶原分子之间交联的形成至关重要。与牛胶原蛋白制剂不同，自体胶原蛋白不会引起接受者的免疫反应，但作为补充剂效果不够好。通过移植自体成纤维细胞产生局部胶原蛋白可以实现稳定的矫正。然而，在临床研究自体成纤维细胞移植的效果时发现了一些困难。成纤维细胞移植后的早期，临床效果不如引入牛胶原蛋白后的效果。在培养自体成纤维细胞时，不能排除正常成纤维细胞转化为病理细胞（即所谓的肌成纤维细胞）的可能性，肌成纤维细胞负责纤维化和瘢痕形成，这可以通过成纤维细胞和胶原纤维之间的特定相互作用引起的胶原凝胶收缩来证明。此外，经过体外连续传代后，成纤维细胞失去了合成细胞外基质蛋白的能力。

然而，现在已经通过实验开发出一种培养自体人成纤维细胞的方法，该方法可以消除上述缺点并且不会导致正常成纤维细胞的致癌转化。用这种方法获得的自体成纤维细胞用于修复面部软组织的缺损。在 G. Keller 等人 (2000) 的研究中，治疗了 20 名年龄 37 至 61 岁、患有皱纹和萎缩性疤痕的患者。从耳后区域采集的皮肤活检样本 (4 毫米) 放在装有 10 毫升培养基（含抗生素、抑菌剂、丙酮酸和胎牛血清的 Eagle 培养基）的无菌试管中送至实验室。将材料放在 3-5 个直径 60 毫米的培养皿中，并在含有 5% CO2 的恒温箱中孵育。1 周后，通过胰蛋白酶消化从培养皿中取出细胞并放在 25 cm2 的小瓶中。将4 x 107个细胞注射到患者体内。在患者矫正鼻唇沟期间以及在第三次自体成纤维细胞移植后7个月和12个月，疤痕患者中均观察到显著且持久的临床效果。流式细胞术检测显示，培养的成纤维细胞产生了大量I型胶原蛋白。体外研究表明注射的成纤维细胞收缩性正常。在裸鼠皮下注射4 x 107个细胞培养的成纤维细胞两个月后，未检测到肿瘤。注射的成纤维细胞未导致患者出现疤痕或弥漫性纤维化。据作者介绍，植入的自体成纤维细胞能够持续产生胶原蛋白，从而提供美容嫩肤的效果。同时，由于分化细胞的寿命有限，因此从年轻患者体内提取的成纤维细胞比从老年人体内提取的成纤维细胞更有效。未来，我们设想可以冷冻保存从年轻捐赠者体内提取的成纤维细胞培养物，以便日后将其自身的年轻细胞移植到老年患者体内。总而言之，认为自体成纤维细胞（只要其功能得到保存）是修复面部软组织缺损的理想方法，这种结论并不完全正确。同时，作者本人也指出，在研究过程中，使用自体成纤维细胞-胶原蛋白系统时出现了一些问题。其临床效果通常不如使用牛胶原蛋白，这导致患者感到失望。

总体而言，关于间充质干细胞临床应用前景的文献数据看起来相当乐观。人们正在尝试使用自体骨髓多能间充质祖细胞治疗退行性关节病变。首次使用培养的间充质祖细胞治疗复杂骨折的临床试验正在进行中。自体和同种异体间充质骨髓基质细胞用于构建软骨组织，用于移植以矫正因创伤或自身免疫病变造成的关节软骨缺损。目前正在开发多能间充质祖细胞的临床应用方法，以消除因I型胶原基因突变导致严重成骨不全的儿童的骨缺损。骨髓消融后，受者儿童将接受来自HLA相容的健康供者的骨髓移植，因为未分化的骨髓中含有足够数量的间充质干细胞来弥补严重的骨缺损。此类儿童接受同种异体骨髓移植后，骨小梁组织学出现积极变化，生长速度加快，骨折发生率降低。在某些情况下，移植亲缘关系密切的同种异体骨髓和成骨细胞可取得积极的临床效果。间充质干细胞移植也用于治疗因骨组织中成骨细胞和破骨细胞比例失衡而导致的先天性骨质脆弱。在这种情况下，通过患者骨组织中干细胞和祖细胞基质细胞的嵌合，可恢复骨形成。

为了修复基质组织的基因缺陷，供体间充质干细胞的基因改造方法正在不断改进。预计在不久的将来，间充质祖细胞将用于神经病学，用于脑细胞的定向嵌合，并建立健康的细胞库，这些细胞能够产生导致疾病临床表现的缺陷酶或因子。间充质干细胞移植可用于修复癌症患者放化疗后的骨髓基质，并与骨髓细胞联合使用，用于恢复造血功能。基质生物材料或仿生学设计领域的工程学进展，以及由间充质干细胞子代构建的框架，促进了旨在利用间充质干细胞消除肌肉骨骼系统缺陷的替代疗法的发展。

间充质干细胞的来源

间充质干细胞的主要来源是骨髓，哺乳动物体内的造血干细胞不断分化为血液和免疫系统细胞，而间充质干细胞则以骨髓基质中的一小群成纤维细胞样细胞为代表，有助于维持造血干细胞的未分化状态。在一定条件下，间充质干细胞分化为软骨和骨组织细胞。在低密度种植条件下，骨髓单核基质细胞接种于培养基中时，会形成粘附细胞集落，这些粘附细胞实际上是成纤维细胞样的多能间充质祖细胞。一些作者认为，未定向的间充质干细胞沉积在骨髓中，由于它们具有自我更新和高分化潜能，在哺乳动物的整个生命周期中为身体的所有组织提供基质元素的间充质前体。

在骨髓中，基质细胞成分构成网络，填充窦状隙和骨组织之间的空间。成人骨髓中休眠状态的间充质干细胞 (MSC) 含量与造血干细胞数量相当，不超过 0.01-0.001%。从骨髓中分离且未经培养的间充质干细胞缺乏粘附分子。此类 MSC 不表达 CD34、ICAM、VCAM、I 型和 III 型胶原蛋白、CD44 和 CD29。因此，在体外，固定在培养基质上的并非间充质干细胞，而是更高级的间充质干细胞的祖细胞衍生物，这些细胞已经形成了细胞骨架的组成部分和细胞粘附分子的受体结构。即使在外周血中也发现了具有 CD34 表型的基质细胞，尽管在骨髓中，它们的数量明显少于 CD34 阳性单核细胞。从血液中分离出的 CD34 细胞转移到培养物中，附着在基质上并形成成纤维细胞样细胞群落。

众所周知，在胚胎时期，哺乳动物和人类所有器官和组织的基质基础均源自于器官形成前及形成阶段的共同间充质干细胞库。因此，人们认为，在成熟的生物体中，大多数间充质干细胞应该存在于结缔组织和骨组织中。已确定，疏松结缔组织和骨组织基质的主要细胞成分是定向祖细胞，但它们保留了体外增殖和形成克隆的能力。当这些细胞被引入全身血液循环时，超过 20% 的间充质祖细胞会被植入造血组织和实质器官的基质成分中。

间充质干细胞的一个潜在来源是脂肪组织，其中已鉴定出不同程度定向分化的脂肪细胞前体细胞。脂肪组织中成熟度最低的祖细胞是基质血管细胞，它们与骨髓的多能间充质前体细胞类似，在糖皮质激素、胰岛素样生长因子和胰岛素的作用下能够分化为脂肪细胞。在培养条件下，基质血管细胞可分化为脂肪细胞和软骨细胞；而在骨髓来源的脂肪组织中，存在可形成脂肪细胞和成骨细胞的细胞。

基质干细胞也已在肌肉中发现。在从人类骨骼肌中分离的细胞原代培养中，检测到了星状细胞和多核肌管。在马血清存在下，星状细胞在体外增殖，无细胞分化迹象；在培养基中添加地塞米松后，其分化特征为出现具有骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨、软骨和脂肪组织表型的细胞成分。因此，人类肌肉组织中既存在定向的，也存在未定向的多能间充质祖细胞。研究表明，骨骼肌中存在的祖细胞群源自骨髓中未定向的多能间充质祖细胞，与成肌卫星细胞不同。

在新生大鼠的心肌中也发现了具有分化潜能的多能间充质祖细胞所对应的粘附星状细胞，因为它们在地塞米松的作用下分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、骨骼肌肌管和心肌细胞。研究表明，血管平滑肌细胞（周细胞）是未分化的血管周多能间充质祖细胞的衍生物。在培养条件下，血管周间充质干细胞表达平滑肌α-肌动蛋白和血小板衍生的生长因子受体，并且至少能够分化为平滑肌细胞。

从干细胞储备的角度来看，软骨组织占据着特殊的地位，其极低的修复潜力被认为是由于缺乏多能间充质祖细胞或分化因子和生长因子。据推测，预先致力于软骨和成骨的多能间充质祖细胞是从其他组织来源进入软骨组织的。

肌腱中间充质祖细胞的组织来源和定向分化条件尚不明确。实验观察表明，在出生后早期，原代培养和第一代兔跟腱细胞保留了I型胶原和核心蛋白聚糖的表达，但随着进一步培养，它们会失去肌腱细胞的分化标志。

需要注意的是，对于位于各种组织的多能间充质祖细胞是否实际上一直存在于其基质中，或者间充质干细胞的组织池是否由骨髓基质干细胞的迁移来补充的问题，尚未得到答案。

除了骨髓和成人机体的其他间充质组织区外，脐带血也可作为间充质干细胞（MSC）的另一个来源。研究表明，脐带静脉血中含有与多能间充质祖细胞具有相似形态和抗原特征的细胞，这些细胞具有粘附能力，且分化潜能不逊于骨髓来源的多能间充质祖细胞。在脐带血间充质干细胞培养物中，发现了5%至10%的未定向多能间充质祖细胞。结果表明，脐带血中未定向多能间充质祖细胞的数量与孕周成反比，这间接表明多能间充质祖细胞在胎儿发育过程中会迁移到各种组织。首次出现了关于从脐带血中分离的间充质干细胞以及从胚胎生物材料中获得的间充质干细胞的临床应用的信息，这是基于胎儿干细胞在成人接受者的器官和组织系统中整合、植入和发挥作用的已知能力。

寻找间充质干细胞的新来源

使用胚胎来源的间充质干细胞以及其他胎儿细胞会引发一系列伦理、法律、司法和立法问题。因此，对胚胎外供体细胞材料的探索仍在继续。将人体皮肤成纤维细胞用于临床的尝试未能成功，这不仅是因为该技术的成本高昂，还因为成纤维细胞会快速分化成成纤维细胞，而成纤维细胞的增殖潜力显著降低，且产生的生长因子数量有限。骨髓间充质干细胞（MSC）和多能间充质祖细胞生物学研究的进一步进展，使我们能够制定自体间充质干细胞的临床应用策略。其分离、培养、体外增殖和定向分化技术首先需要研究MSC的分子标记谱。分析表明，人体骨组织的原代培养物含有多种类型的多能间充质祖细胞。在表达基质祖细胞标志物STRO-1但不携带成骨细胞标志物碱性磷酸酶的细胞中检测到了成骨细胞表型。此类细胞的特征是形成矿化骨基质的能力较低，并且不表达骨桥蛋白和甲状旁腺激素受体。不表达碱性磷酸酶的STRO-1阳性细胞的衍生物以中度和完全分化的成骨细胞为代表。研究发现，STRO-1阳性人类骨小梁细胞克隆系的细胞成分能够分化为成熟的骨细胞和脂肪细胞。这些细胞的分化方向取决于多不饱和脂肪酸、促炎细胞因子IL-1β和肿瘤坏死因子α（TNF-α）以及抗炎和免疫抑制TGF-β的作用。

后来发现，多能间充质祖细胞缺乏其特有的表型，但在没有造血细胞免疫表型抗原（CD45、CD34 和 CD14）表达的情况下，表达间充质、内皮、上皮和肌肉细胞特征性标志复合物。此外，间充质干细胞组成性地和诱导性地产生造血和非造血生长因子、白细胞介素和趋化因子，并且一些细胞因子和生长因子的受体在多能间充质祖细胞上表达。在人体基质细胞中发现了休眠或静息细胞，其免疫表型与未经 5-氟尿嘧啶处理的多能间充质祖细胞的抗原谱几乎相同——这两个细胞都表达 CD117，标记“成体”干细胞。

因此，间充质干细胞独有的细胞标记尚未确定。人们推测，休眠细胞代表一群未定向的多能间充质祖细胞，因为它们不表达定向成骨细胞（Cbfa-1）或脂肪生成细胞（PPAR-y-2）的标记。缓慢增殖的休眠细胞长时间暴露于胎牛血清中，可形成终末分化的定向祖细胞，其特征是快速生长。FGF2 支持此类间充质干细胞的克隆扩增。基质干细胞的基因组似乎相当“封闭”。有报道称，MSC 缺乏自发分化——如果没有特殊的定向条件，它们甚至不会转化为间充质谱系的细胞。

为了研究间充质干细胞衍生物的群体结构，在基质细胞系和原代培养物中寻找分化标志蛋白。骨髓集落形成细胞的体外克隆分析表明，当应用于原代培养物时，EGF会增加平均集落大小并降低碱性磷酸酶的克隆表达，而添加氢化可的松则会激活碱性磷酸酶的表达，碱性磷酸酶是MSC分化成骨方向的标志。STRO-1单克隆抗体使得在异质Dexter培养系统中分离和研究STRO-1阳性粘附细胞群成为可能。已经确定了一系列细胞因子，它们不仅调节造血细胞和淋巴细胞的增殖和分化，而且还通过旁分泌、自分泌和内分泌机制参与骨骼组织的形成、形成和吸收。受体介导的cAMP、二酰甘油、肌醇三磷酸和Ca2+等次级信使的释放也可用于对表达相应受体的各类基质组织细胞进行标记分析。使用单克隆抗体作为标记物，可以确定淋巴器官基质中的网状细胞属于T细胞和B细胞依赖区。

一段时间以来，围绕MSC是否可能源自造血干细胞的问题，科学界一直争论不休。事实上，当将骨髓细胞悬液移植到单层培养物中时，成纤维细胞会在其中生长出离散的集落。然而，研究表明，骨髓中存在成纤维细胞集落前体和各种造血组织分化的芽体，并不能证明它们共同源自造血干细胞。通过对骨髓干细胞进行判别分析，确定异位骨髓移植过程中的微环境并未被造血细胞转移，这证明了骨髓中存在一个在组织发生学上独立于造血细胞的MSC群体。

此外，选择性克隆方法使我们可以在骨髓细胞单层培养中识别出一类新的基质祖细胞，确定它们的数量，并研究它们的特性、增殖和分化潜能。结果表明，基质成纤维细胞样细胞在体外增殖并形成二倍体集落，这些集落移植回体内后可形成新的造血器官。对单个克隆的研究结果表明，在基质祖细胞中，有一群细胞因其增殖和分化潜能可以发挥基质组织干细胞的作用，在组织发生学上独立于造血干细胞。该群体细胞的特点是能够自我维持生长，并分化为骨、软骨和骨髓网状组织的祖细胞元素。

R. Chailakhyan 及其合著者（1997-2001）的研究成果尤为引人注目，他们在添加胎牛血清的 a-MEM 培养基中培养了兔、豚鼠和小鼠的骨髓基质祖细胞。作者以每平方厘米 2-4 x 103 个骨髓细胞的初始密度进行移植。使用同源或异源辐射灭活的骨髓细胞作为饲养细胞，其剂量应保留饲养细胞效应，但完全抑制其增殖。将两周龄的原代成纤维细胞分离集落用胰蛋白酶消化，以获得单克隆菌株。利用雄性和雌性豚鼠混合骨髓培养中的染色体标记、活体培养物的延时摄影以及 CBA 和 CBAT6T6 小鼠同基因骨髓混合培养中的染色体标记，获得了克隆来源的证据。在伊娃隆或明胶多孔支架以及灭活兔松质骨基质中，将新鲜分离的骨髓细胞或体外培养的基质成纤维细胞悬液移植到肾包膜下。对于骨鞘中克隆的移植，清除豚鼠股骨的软组织和骨膜，修剪骨骺，并彻底冲洗掉骨髓。将骨切成碎片（3-5 毫米），干燥，并以 60 Gy 的剂量进行辐照。将单个成纤维细胞群落放入骨鞘中并进行肌肉内植入。对于体外生长的基质成纤维细胞的腹膜内移植，使用 A 型（V=0.015 cm3，h=0.1 mm）和 O 型（V=0.15 cm3，h=2 mm）扩散室。

R. Chailakhyan 等人 (2001) 在研究克隆菌株的生长动力学时发现，形成成纤维细胞集落的单个细胞及其后代具有巨大的增殖潜力。到第 10 代时，某些菌株的成纤维细胞数量达到 1.2-7.2 x 10 ^{9 个}细胞。在它们发育的过程中，它们进行了多达 31-34 次细胞倍增。在这种情况下，由几十个克隆的基质前体细胞形成的骨髓衍生菌株的异位移植导致了骨髓微环境的转移和移植区新造血器官的形成。作者提出了一个问题：单个克隆是否能够转移基质细胞的骨髓微环境，或者是否需要几种不同的克隆形成基质前体的合作？如果单个克隆能够转移微环境，那么对于所有三个造血芽来说，微环境是否都是完整的，或者不同的克隆是否为不同的造血芽提供微环境的形成？为了解决这些问题，开发了一种在胶原凝胶上培养基质祖细胞的技术，可以将生长的成纤维细胞集落从表面移除，以便随后进行异位移植。从 CBA 小鼠和豚鼠的骨髓细胞中生长出来的单个基质成纤维细胞克隆与凝胶涂层的碎片一起被切除，并进行异位移植——移植到同基因小鼠的肾包膜下或自体豚鼠的腹部肌肉中。当移植到肌肉中时，凝胶上的集落被放置在骨鞘中。

作者发现，骨髓成纤维细胞集落移植后50-90天，20%的病例在移植区观察到骨或骨和造血组织的发育。在5%的受体动物中，形成的骨组织灶内有一个充满骨髓的空腔。在骨圆柱体内部，这些灶呈圆形，并有一个由骨组织构成的包膜，包膜内含有骨细胞和发育良好的成骨细胞层。骨髓腔内含有网状组织，包含髓系和红系细胞，其比例关系与正常骨髓无异。在肾脏中，移植器官是典型的自体骨髓移植过程中形成的骨髓器官，骨包膜仅从肾包膜侧面覆盖骨髓腔。造血组织包括髓系、红系和巨核细胞成分。骨髓腔基质具有发育良好的窦道系统，并含有典型的脂肪细胞。同时，在部分克隆的肾包膜下移植区发现了没有造血迹象的骨组织。继续在兔单克隆骨髓株上研究单个克隆的增殖和分化潜能，将这些细胞悬浮在营养培养基中，并在单独的1-2毫克质量的伊万隆海绵中移植到兔骨髓供体的肾包膜下。21个单克隆株的细胞进行了这样的自体移植。2-3个月后评估结果。作者发现，在14%的病例中，移植的单克隆株形成了由骨组织和充满造血细胞的骨髓腔组成的骨髓器官。在33%的病例中，移植的株形成了大小不一的致密骨，骨细胞嵌入在腔内，成骨细胞层发达。在某些情况下，移植克隆的海绵中会形成不含骨或造血细胞的网状组织。有时，会形成具有发达窦状隙网络的网状基质，但不会形成造血细胞。因此，所获得的结果与在胶原凝胶上移植克隆时获得的数据相似。但是，如果移植在基质上生长的克隆会导致 5% 的病例形成骨髓组织，15% 的病例形成骨组织，80% 的病例形成网状组织，那么移植单克隆菌株则会在 14% 的病例中观察到骨髓细胞的形成，53% 的病例形成骨组织，53% 的病例形成网状组织。据作者所述，这表明，在多孔支架上移植时，基质成纤维细胞实现增殖和分化潜能的条件比在骨鞘和胶原基质上移植时更为理想。使用更先进的克隆培养和反向移植方法，有可能改善克隆发挥其分化潜能的条件，并改变这些比例。无论如何，本研究的主要意义在于，一些基质细胞克隆能够形成骨组织，并同时为三种骨髓造血芽体（红细胞、髓系和巨核细胞）提供基质造血微环境，从而形成相当大的造血组织平台和一些骨量。

作者随后探讨了单个克隆形成性基质祖细胞在封闭的扩散室系统中进行此类细胞分化的能力问题。此外，还需要确定单个克隆是否具有多能性，或者分化潜能的发挥是否需要多个具有固定细胞分化特性的克隆协同作用，而这些特性的不同比例决定了骨、网状或软骨组织的优先形成。通过结合两种方法——获取骨髓基质祖细胞单克隆株并将其移植到扩散室中——R. Chailakhyan 及其合著者 (2001) 获得了使他们能够更深入地了解骨髓基质结构的结果。将基质祖细胞单克隆株移植到 O 型室中导致骨和软骨组织的形成，表明单个基质集落形成细胞的后代能够同时形成骨和软骨组织。骨和软骨组织起源于共同的基质祖细胞的假设已被反复提出。然而，这一假设缺乏正确的实验证实。扩散室中骨和软骨的形成是骨髓基质干细胞中存在这两种组织共同祖细胞的必要证明。

然后将从兔骨髓原代培养物中获得的29个第二至第三代克隆菌株置于扩散室中，并通过腹膜内植入同源动物。研究表明，45%的骨髓单克隆菌株具有成骨潜能。9个腔室仅含有网状组织，但另外13个腔室中网状组织与骨和软骨组织同时存在，占所有菌株的76%。在O型腔室中，骨和软骨组织都可能分化，研究了16个菌株。在四个腔室（25%）中，骨和软骨组织都形成了。再次需要注意的是，在R. Chailakhyan等人（2001）的研究中，单个祖细胞在一个细胞株内经历了31至34次倍增，它们的子代细胞包含0.9-2.0 x 10 ^{9 个}细胞。多克隆株的祖细胞经历的有丝分裂次数与单克隆株几乎相同。多克隆株的发育速度，尤其是在其形成的第一阶段，在很大程度上取决于用于起始株的集落数量。人类胚胎成纤维细胞（WI-38）的二倍体株在12-15次倍增水平时重新克隆，也形成了直径和细胞含量不同的集落。含有超过10 3 个细胞的大集落仅占5-10%。随着分裂次数的增加，大集落的比例下降。骨髓基质成纤维细胞的单克隆和多克隆株在20次或更多次倍增后仍保留着一组二倍体的染色体，其发育趋势与胚胎成纤维细胞二倍体株的发育动力学相当。通过将单克隆菌株移植到扩散室中，对单个骨髓基质祖细胞的分化潜能进行了分析，结果表明其中一半具有成骨性。大型集落占其总数的10%。因此，成骨集落形成细胞的数量约占其总细胞群的5%。作者鉴定出的成骨祖细胞总量包括能够同时形成骨和软骨组织的细胞。此外，首次证实了成年生物体中这两种组织类型具有共同的祖细胞：25%的测试克隆是由此类细胞产生的，它们在祖细胞总数中的比例至少为2.5%。

因此，骨髓成纤维细胞单个克隆的异位移植揭示了间充质祖细胞群结构组织的新方面。已发现基质祖细胞能够一次性为所有造血芽转移特定的微环境，在不同模型中研究的大型克隆中，此类细胞的数量范围为5%至15%（占检测到的祖细胞总数的0.5%至1.5%）。除了转移完整骨髓微环境的克隆外，还有一些仅决定成骨的祖细胞，当它们在开放系统中转移时，会形成不支持造血发育的骨组织。它们占祖细胞总数的1.5%至3%。其中一些细胞能够形成骨组织，但其自我维持时间有限。因此，基质祖细胞群的分化潜力存在异质性。其中有一类细胞被称为基质干细胞，能够向骨髓基质组织特有的三个方向分化，即形成骨、软骨和网状组织。这些数据让我们有希望利用各种细胞标记物来确定每种基质细胞在Dexter培养中对特定微环境的构建和造血支持的贡献。

间充质干细胞的特点

近年来已证实，在静止的骨髓培养中，多能间充质祖细胞表现为数量有限的小无颗粒细胞（RS-1 细胞），其特点是克隆形成能力低且不表达增殖细胞特异性 Ki-67 抗原。休眠 RS-1 细胞的抗原参数与快速增殖的定向基质祖细胞的抗原谱不同。已证实，仅在存在 RS-1 细胞的情况下才能观察到定向祖细胞的高增殖率。反过来，在多能间充质祖细胞最成熟的衍生物所分泌的因子的影响下，RS-1 细胞的生长率会增加。RS-1 细胞似乎是能够循环利用的未定向 MSCs 的一个亚类。在体外，5-氟尿嘧啶抗性的骨髓基质祖细胞具有 RNA 含量低和鸟氨酸脱羧酶基因（非增殖细胞的标志）高表达的特点。

基质祖细胞在固定于基质后开始密集增殖。此时，其表达低分化细胞的标志物特征：SH2（TGF-(3) 受体）、SH3（信号蛋白结构域）、I 型和 III 型胶原、纤连蛋白、粘附分子受体 VCAM-1（CD106）和 ICAM（CD54）、钙粘蛋白-11、CD44、CD71（转铁蛋白受体）、CD90、CD120a 和 CD124，但不表达造血干细胞的特征性标志物（CD34、CD14、CD45）。克隆性生长使间充质干细胞能够反复传代，并在培养中形成大量基因均一的基质祖细胞多能性细胞。经过 2-3 代传代后，其数量可达到 5000 万至 3 亿。在足够密度的培养条件下，基质祖细胞在增殖停止后，与造血组织成纤维细胞不同，会分化为脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞和骨细胞。三种调控分化信号的组合，包括1-甲基异丁基黄嘌呤（胞内cAMP形成的诱导剂）、地塞米松（磷脂酶A和C的抑制剂）和吲哚美辛（环氧合酶的抑制剂，也能降低血栓素合酶的活性），可将高达95%的间充质祖细胞转化为脂肪细胞。脂蛋白脂肪酶基因的表达、载脂蛋白和过氧化物酶体受体的组织化学检测可证实未成熟基质成分已形成脂肪细胞。在无血清培养基中，在TGF-β的影响下，同一克隆的细胞可形成均质的软骨细胞群。该软骨组织的多层细胞培养物的特征在于其细胞间基质发达，由蛋白多糖和II型胶原组成。在含有10%β-甘油磷酸盐（一种无机磷酸盐供体）、抗坏血酸和地塞米松的培养基中，在相同的基质祖细胞培养物中，分化信号复合物的作用导致细胞聚集体的形成。在这些细胞中，碱性磷酸酶活性和骨桥蛋白水平逐渐升高，这表明骨组织正在形成，细胞的矿化作用通过细胞内钙含量的逐渐升高得到证实。

一些数据显示，间充质干细胞能够无限分裂，并繁殖出各种类型的间充质分化细胞，同时还具有很强的可塑性。当间充质干细胞被引入脑室或脑白质时，它们会迁移到神经组织实质，并分化为神经胶质细胞或神经元细胞系的衍生物。此外，还有关于 MSCs 在体内和体外转分化为造血干细胞的信息。一些研究的更深入分析表明，MSCs 具有极高的可塑性，表现为它们能够分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、心肌细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞。大量关于 MSCs 体内外转分化潜能的研究已证实，骨髓来源的多能间充质祖细胞最终可分化为形成骨、软骨、肌肉、神经和脂肪组织以及支持造血的肌腱和基质的细胞系。

然而，其他研究未能揭示间充质干细胞基因组和基质细胞祖细胞群多能性受到限制的迹象，尽管研究了从一种原代培养物中分离出的 200 多个 MSCs 克隆，以测试基质细胞可能的多能性。绝大多数体外克隆保留了向成骨、软骨和脂肪形成方向分化的能力。当通过将间充质干细胞移植到肾包膜下或扩散室中排除受体细胞迁移的可能性时，结果表明原位基质祖细胞保留了异质性表型，这表明移植区不存在限制因素或不存在 MSC 多能性。同时，允许存在一种罕见类型的体细胞多能干细胞，它们是所有成体干细胞的共同前体。

真正的间充质干细胞只占骨髓细胞的极小部分，在体外培养的特定条件下可增殖但不分化，它们具有多能性，但非万能性，这通过它们被诱导定向为骨、软骨、脂肪、肌肉组织细胞以及肌腱细胞和支持造血的基质成分得到证明。通常，长时间暴露于含有胎牛血清的培养基中会促使 MSCs 释放为定向的基质祖细胞，其子代细胞会自发进行终末分化。在体外，可以通过向培养基中添加地塞米松、β-甘油磷酸和抗坏血酸来实现成骨细胞的靶向形成，而地塞米松和胰岛素分化信号的组合可诱导脂肪细胞的形成。

已确定，在进入终末分化阶段之前，骨髓 MSCs 在特定培养条件下首先分化为成纤维细胞样间充质干细胞。这些细胞的衍生物在体内参与骨骼、软骨、肌腱、脂肪和肌肉组织以及支持造血的基质的形成。许多作者将“多能间充质祖细胞”理解为既指 MSCs 本身，也指骨髓和间充质组织的定向基质祖细胞。对骨髓来源的多能间充质祖细胞的克隆分析表明，略多于三分之一的克隆分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，而其余克隆的细胞仅具有成骨潜能，仅形成软骨细胞和骨细胞。在适当的微环境条件下，多能间充质祖细胞（例如BMC-9）的克隆细胞不仅能分化成具有成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞表型和功能特征的细胞，还能分化成支持造血的基质细胞。从大鼠胎儿骨髓中分离的RCJ3.1细胞克隆可分化成各种表型的间充质细胞。在抗坏血酸、β-甘油磷酸和地塞米松的共同作用下，该克隆细胞的细胞成分首先形成多核肌细胞，然后依次形成脂肪细胞、软骨细胞和矿化骨组织的胰岛。来自大鼠胎儿骨膜的颗粒细胞群对应于未定向的多能间充质祖细胞，因为其特点是增殖率低，不表达分化标志，并且在培养条件下分化形成软骨、骨和脂肪细胞以及平滑肌细胞。

因此，应该认识到，间充质干细胞基因组的多能性或多能性问题仍然悬而未决，因此，这也影响了关于基质祖细胞分化潜力的想法，而基质祖细胞的分化潜力也尚未最终确定。

间充质干细胞的一个经实验证实的重要特性是其能够离开组织微环境并进入全身血液循环。为了激活遗传分化程序，这些循环干细胞必须进入适当的微环境。研究表明，通过将间充质干细胞系统性地引入受体动物的血液中，未成熟细胞会被植入各种器官和组织，然后分化为血细胞、肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞和成纤维细胞。因此，在局部组织区域，未定向和定向的基质祖细胞之间，以及它们与周围成熟细胞之间会发生信号调节相互作用。据推测，分化是由间充质和非间充质来源的旁分泌调节因子（生长因子、类花生酸、细胞外基质分子）诱导的，这些因子在多能间充质祖细胞的微环境中提供空间和时间连接。因此，间充质组织的局部损伤会导致多能间充质祖细胞微环境区域的形成，这些区域与完整组织的调控信号复合物在性质上存在差异，在完整组织中发生的是生理性再生过程而非修复性再生过程。这种差异对于细胞在正常和损伤诱导的微环境中表型的特化至关重要。

根据这些概念，两种已知过程——生理性再生和炎症性增殖——之间的根本区别机制就在于此。生理性再生最终导致组织特化细胞组成及其功能的恢复，而炎症性增殖过程的实施则导致成熟结缔组织成分的形成和受损组织区域功能的丧失。因此，为了开发多能间充质祖细胞在再生医学中的最佳应用方案，有必要深入研究微环境因素对间充质干细胞分化的影响特征。

毫无疑问，干细胞区室的结构依赖于细胞旁分泌和自分泌调节剂，而这些调节剂的表达受外部信号调节。在调节因子的功能中，最重要的是控制 MSC 的不对称分裂和决定细胞分裂阶段和次数的基因的表达。MSC 的进一步发育依赖于外部信号，而这些信号由其微环境提供。在未成熟状态下，MSC 会长时间增殖，同时保持分化为脂肪细胞、肌成纤维细胞、造血组织基质、软骨和骨细胞的能力。已经确定，血液循环中有限数量的 CD34 阴性基质细胞元素会从一般血液返回骨髓基质，在那里转化为 CD34 阳性造血干细胞系。这些观察结果表明，间充质祖细胞在血液中的再循环通过动员骨髓中共同的未成熟基质成分池，维持了不同器官中基质干细胞的组织平衡。间充质干细胞分化为具有多种间充质表型的细胞，并参与骨、软骨、脂肪组织和肌腱的体内再生或修复，已在实验动物的过继移植模型中得到证实。其他作者的研究发现，在软骨修复、肌肉再生和其他修复过程中，间充质祖细胞沿血管床的远距离迁移与组织内多能间充质祖细胞的短距离或局部移动相结合。

基质组织基底的局部干细胞储备在生理性组织再生过程中充当细胞来源，随着基质组织干细胞资源的消耗，MSCs 通过远距离运输进行补充。然而，在需要紧急调动修复性细胞潜能的情况下，例如在多发性创伤的情况下，整个MSCs梯队都会参与修复性再生过程，骨髓的间充质祖细胞会通过全身血流被募集到外周。

间充质干细胞移植

生理组织再生过程与其在宫内发育过程中的形成之间存在某些相似之处。在人类和哺乳动物的胚胎发生过程中，各种类型的特化细胞的形成发生在外胚层、中胚层和内胚层胚层池中，但间充质的参与必不可少。胚胎间充质组织松散的细胞网络发挥着多种调节、代谢、框架和形态发生功能。临时器官的形成仅在间充质因祖细胞的克隆性生长而凝聚之后发生，祖细胞产生器官发生的原始形态发生信号。胚胎间充质的基质衍生物构成了临时器官的细胞框架，并为其未来由于原代血管和淋巴管生长而进行的能量塑性供应奠定了基础。换句话说，胎儿器官微循环单元的基质元素在其结构和功能单元形成之前就已出现。此外，在器官发生过程中，间充质细胞的主动迁移通过限制同源异型Hox类型的表达来标记体积边界，从而为发育中的器官提供空间定位。基质框架也是实质器官结构和功能单元组装的基础，而实质器官通常包含形态发生和功能完全不同的细胞。因此，在胚胎发生过程中，间充质的功能是主要的，并通过产生调控信号来实现，这些信号激活上皮祖细胞的区域增殖和分化。胚胎间充质细胞产生生长因子，例如HGF-β、HGF-β1和CSF，而实质祖细胞具有相应的受体。在成年生物体分化成熟的组织中，细胞基质网络也产生信号，以维持非间充质来源的祖细胞的活力和增殖。然而，出生后个体发生中基质调控信号的范围是不同的（SCF、HGF、IL-6、IL-1、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、GM-CSF、flt-3、LIF 等），目的是确保受损组织区域的生理再生或修复。此外，每种组织甚至同一器官中基质调控因子的光谱特征都不同。特别是，造血和淋巴细胞生成以及造血和免疫活性细胞的增殖和分化仅发生在某些器官中，基质微环境在这些器官的边界内运作，为造血和淋巴细胞的成熟提供条件。造血和淋巴细胞重新填充特定器官、在其微结构微环境中增殖和成熟的能力取决于微环境的调控因素。

多能间充质祖细胞产生的细胞外基质成分中，值得一提的是纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、蛋白聚糖以及CD44（透明质酸和骨桥蛋白受体），它们在组织细胞间相互作用以及形成骨髓和骨组织中的细胞外基质方面发挥着重要作用。已证明，骨髓多能间充质祖细胞能够创造基质微环境，不仅向MSC，而且向骨髓的造血祖细胞和其他非间充质干细胞提供诱导和调控信号。已知MSC参与造血取决于其分化为支持造血的基质细胞的能力，而这种指导信号是MSC直接从造血干细胞接收的。这就是为什么在培养中基质祖细胞网络可以作为所有造血细胞克隆发育的饲养基地。

在成熟的生物体中，造血和淋巴细胞生成的强度与周围成熟血细胞和免疫系统细胞的“消耗”处于动态平衡状态。由于骨髓和淋巴器官的基质细胞极少更新，因此其中的基质结构不会发生显著的重组。任何造血或淋巴器官受到机械损伤都可能使该系统失去动态平衡，从而导致一致的连续变化，这些变化不仅涉及造血或淋巴元素，还涉及受损器官的基质结构。在修复性再生过程中，首先形成基质基底，然后由造血细胞或免疫活性细胞重新填充。这一早已为人所知的事实使创伤后再生成为研究造血器官基质微环境的便捷模型。尤其是管状骨髓腔的机械排空用于研究骨髓的修复性再生——刮除术，这种方法可以快速有效地将造血组织从动态平衡状态中移除。在研究豚鼠胫骨髓腔机械排空后骨髓造血和基质成分的修复性再生过程时发现，造血细胞和基质细胞再生指标（造血细胞数量、基质祖细胞的浓度和数量）之间没有直接相关性。此外，还发现基质祖细胞数量的增加发生在刮除术后较早的时间，基质成纤维细胞本身变为磷酸酶阳性，这是成骨组织的典型特征。还已证实，刮除 3-5 根管状骨会导致这种细胞群在未手术骨骼的骨髓中甚至在脾脏中生长，而脾脏是豚鼠唯一的淋巴细胞生成器官。

豚鼠胫骨刮除术后骨髓修复过程的形态学图像与文献中描述的其他物种动物实验数据基本一致，且所有动物在移除造血组织后发生的变化动力学相同，差异仅在于时间参数。形态学上，清空髓腔后造血修复的阶段顺序包括血凝块组织化、粗纤维骨组织形成、骨吸收、窦状隙发育和网状基质形成（随后由造血细胞重新填充）的连续过程。在这种情况下，骨髓组织再生过程中祖细胞的数量与造血干细胞含量的增加同步增加。

Yu. Gerasimov 和合著者 (2001) 比较了再生过程各个阶段造血细胞数量和基质祖细胞数量的变化。结果表明，刮除骨中骨髓细胞的数量变化与再生形态特征的动态相对应。作者将前三天再生组织中细胞含量的减少与造血细胞的死亡联系起来，死亡原因是骨骺区保存的骨髓中增生的网状组织造成的微环境的不利影响，以及骨骺区骨样组织灶的形成和刮除过程中的血管损伤。在第 7 至 12 天，有核细胞水平的增加与基质元素增生区中单个髓系造血灶的出现相一致。第20天，可见明显的再生骨髓区域及发育良好的窦道，并伴随细胞总数的显著增加。然而，此期间造血细胞数量仅为对照组的68%。这与之前发表的刮除术后造血细胞数量在术后35-40天才达到正常值的数据一致。

在创伤后早期，造血功能恢复的主要来源是刮除术中保存的局部细胞成分。在后期，骨髓造血组织再生的主要来源是重新填充游离基质区的干细胞。至于基质细胞的具体种类（内皮细胞、网状细胞和成骨细胞），在骨髓腔重组过程中确保其形成的来源尚不清楚。Yu. V. Gerasimov 等人（2001）的研究结果表明，在刮除术保存的骨髓中，成纤维细胞集落形成细胞的浓度明显高于正常骨髓。作者认为，与集落形成性基质细胞相比，刮除术会导致造血细胞的选择性冲洗更为强烈，而集落形成性基质细胞参与了基质的形成，并且与基质的主要成分的结合比造血细胞更强。

成纤维细胞集落形成细胞数量变化的动态与成骨过程的强度、随后的骨小梁吸收以及由造血细胞填充的网状基质的形成相关。大多数基质祖细胞在特定的再生阶段形成粗纤维骨组织和网状基质。在股骨骨折且长时间进行骨缝合的情况下，在第5天，再生区中成纤维细胞集落形成细胞的浓度和数量会增加，而在骨形成密集期，其数量会增加6倍。已知形成成纤维细胞集落的骨髓细胞具有成骨特性。在造血细胞占据刮除的骨髓区域之前，基质祖细胞的数量就已经增加。这与基质细胞提供造血微环境形成的数据非常吻合。显然，造血微环境的建立与一定程度的基质组织再生相对应，造血细胞的数量随着适合造血的基质平台的扩大而增加。

最令人感兴趣的是作者的数据，刮除术后骨骼远端的基质祖细胞数量立即增加。从术后第六个小时到第二十天（含），在对侧胫骨中观察到成纤维细胞集落形成细胞的浓度和数量均增加了两倍以上。这种现象的机制可能与以下事实有关：大面积骨髓损伤导致大量血栓形成，同时大量血小板被破坏，血小板衍生的生长因子 (PDGF) 释放到血液中，这会导致体内增殖池外成纤维细胞集落形成细胞的增殖。在兔子实验中，局部注射间充质干细胞 (MSCs) 促进了手术损伤膝关节软骨组织的修复，这可能与注射的 MSCs 形成软骨细胞有关。然而，使用陶瓷框架包裹的间充质干细胞，可以显著增强实验室大鼠骨缺损的修复再生。因此，可以假设，如果不是RBOC，那么来自受损基质细胞的其他某种因子会对完整骨髓区域内的间充质祖细胞增殖产生远距离刺激作用，并刺激其向骨髓缺损区域迁移。然而，这与前几年的文献数据相矛盾，这些文献表明，负责微环境的基质细胞与造血细胞不同，无法迁移，并且源自局部。

尽管如此，Yu. Gerasimov 等人（2001）的研究结果表明，机械创伤不仅会导致刮除骨组织中基质组织的急剧重构，还会使远处完整骨骼的基质发生显著变化，即基质组织对局部创伤产生全身性反应。此外，当造成多发性创伤（多次刮除）时，这种反应会增强，不仅在手术骨和远处骨骼中观察到，而且在淋巴器官中，特别是脾脏中也观察到。骨髓和脾脏基质组织对局部创伤和多发性创伤的这种全身性反应的机制仍然未知。据推测，该过程与骨髓髓腔间充质基质分泌的体液因子作用有关。骨髓和脾脏的基质细胞可能产生一种器官非特异性体液因子，该因子可促进形成成纤维细胞集落的细胞增殖，这一点已通过骨髓单层培养中集落刺激活性的数据得到证实。

在这方面，值得注意的是，通过全身给药，多能间充质祖细胞的衍生物不仅能重新填充骨髓，还能重新填充其他组织，这尤其适用于基因治疗。研究表明，通过静脉注射大量具有野生型基因组的间充质干细胞（MSCs），将供体细胞注入胶原蛋白I基因突变的小鼠体内，可替代受体骨骼和软骨组织中高达30%的细胞；而分泌人IL-3的转染小鼠间充质干细胞（如果与人造血干细胞同时注入免疫缺陷小鼠体内，则可有效支持造血长达9个月）。

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间充质干细胞的基因改造

在MSCs基因改造实验中，值得一提的是将IX因子基因转染到人MSCs中，然后将转染细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，结果发现移植后8周内血液中出现了抗血友病因子B。在该实验中，用γ-谷氨酰羧化酶对转染细胞中的IX因子进行了翻译后修饰。将编码人IX因子的逆转录病毒载体转导到MSCs中则不太成功——随后将这些细胞移植到一只患有血友病B的犬体内，仅能达到治疗水平的IX因子水平，并维持正常的凝血止血强度，但效果仅持续了12天。

将间充质干细胞移植到动物脑实质中，已证实供体的未成熟细胞能够转化为神经元和神经胶质细胞群。理论上，植入健康供体间充质组织的神经元衍生物，可以纠正戈谢病以及其他脂质、神经节苷脂或碳水化合物代谢紊乱患者的脑代谢遗传异常。

目前正在实验探索将骨髓基质干细胞转分化为神经和肝脏组织祖细胞的条件。研究人员的注意力集中在分化诱导剂和特殊培养基的组合上。具体而言，为了分离基质细胞的原代培养物，将骨髓细胞清洗并重悬于含有10%胎牛血清的DMEM/F12（1/1）培养基中，以20万个/cm²的密度接种。24小时后，去除未贴壁的细胞，将贴壁的成纤维细胞样细胞培养一周。骨髓基质细胞向神经母细胞的分化，需要使用小鼠胚胎成纤维细胞原代培养三天后获得的条件培养基，以及添加2%胎牛血清和20 ng/ml NF或10-6 M视黄酸（用于小鼠和人类胚胎干细胞神经分化的神经诱导剂）的DMEM/F12（1/1）培养基。骨髓基质细胞向肝细胞前体细胞的分化，需要使用小鼠胚胎肝细胞原代培养三天后获得的条件培养基，以及添加10%胎牛血清的DMEM/F12（1/1）培养基。

这里需要再次指出的是，骨髓基质的集落形成细胞是异形的，可分为两种类型。第一种类型包括成纤维细胞样细胞，它们形成具有大细胞核和一个或两个核仁的丝状伪足。第二种类型以小梭形细胞为代表。当在小鼠胚胎原代成纤维细胞的饲养层上获得的条件培养基中培养这两种类型的细胞时，在第3到4天培养物中会出现类似神经母细胞的细胞。在这个阶段，它们通常呈梭形，有一个或两个长突起，末端是丝状伪足。不太常见的是锥体细胞或星状细胞，它们的树突很短。一些神经母细胞的树突在其远端具有特征性的扩张（生长芽）和分支，而另一些神经母细胞则具有明显的带有丝状伪足的生长锥，树突通过生长锥生长。神经发生研究中详细描述了神经母细胞分化为神经元时所固有的类似形态特征（芽和具有丝状伪足的生长锥）。基于此，一些作者得出结论，他们在培养物中发现的细胞就是神经母细胞。特别是，E. Shchegelskaya 及其合著者（2002）在每3至4天更换一次的条件培养基中将基质细胞原代培养物培养两周后发现，部分细胞在保持未分化状态的同时增殖。这些细胞外观类似于成纤维细胞，在培养物中与分化中的神经母细胞一起被检测到。大多数细胞（约80%）处于分化为神经组织细胞（主要为神经元）的不同阶段。这些细胞的树突彼此紧密接触，因此细胞逐渐在基质上以长多细胞链的形式形成神经网络的各个部分。神经母细胞的树突明显变长，其中一些甚至超过了神经元体本身长度的8-10倍。锥体细胞和星状细胞的比例逐渐增加。星状细胞的树突出现分支。据作者称，与梭形细胞相比，锥体细胞和星状细胞的分化较晚，这与动物正常神经发生的阶段顺序相对应。因此，作者得出结论，骨髓基质干细胞经历了诱导神经发生，在此过程中，三种主要类型的神经元均由神经母细胞在体外形成。在含有2%胎儿血清和20 ng/ml LIF的培养基中培养骨髓基质细胞3-4天时，也检测到了神经细胞前体。但在这种情况下，干细胞分裂非常缓慢，只有30%的病例发生了神经母细胞分化，并且它们没有形成神经网络。使用视黄酸作为神经细胞分化的诱导剂之一，作者在培养物中获得了高达25-30％的神经细胞，主要含有神经胶质细胞——星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经元仅占所有神经细胞的三分之一，尽管它们由梭形细胞、锥体细胞和星状细胞这三种类型组成。在含有视黄酸的培养基中培养基质细胞第六天，神经细胞分化更加明显，在单个锥体神经元中发现了轴突，在正常的神经发生过程中，轴突的出现晚于树突的形成。据作者介绍，尽管神经细胞的产量低，但视黄酸诱导法有其优势：少突胶质细胞和星形胶质细胞在树突和轴突生长过程中发挥髓鞘形成和营养功能，是神经组织正常形成所必需的。因此，为了修复体内受损区域，最好使用富含神经胶质细胞的神经元悬浮液。

在第二组实验中，作者尝试诱导骨髓基质细胞分化为肝细胞。在小鼠胚胎肝细胞培养液中培养骨髓基质干细胞三天后，发现了较大的球形细胞，通常为双核细胞，胞质内含物大小不一。这些细胞处于不同的分化阶段，大小、细胞核数量和胞质内含物均有差异。大多数细胞中检测到糖原，作者据此将其鉴定为肝细胞前体细胞。由于培养液中未发现类似神经母细胞的细胞，因此得出结论，胚胎肝细胞培养液缺乏神经细胞的分化因子，而含有诱导骨髓基质细胞分化为肝细胞前体细胞的因子。总之，作者认为骨髓基质细胞具有多能性，因为它们根据所使用的特定条件培养基和诱导剂在体外分化为神经或肝组织细胞。

一些研究确实正确地证明了骨髓基质细胞能够分化为心肌细胞、软骨细胞、骨细胞和神经组织细胞。有证据表明，骨髓细胞中存在能够分化为肝细胞的干细胞群。鉴于这些数据，上述小鼠实验的结果仍然可以被视为进一步证实骨髓中存在能够分化为成年生物体各种组织细胞的多能间充质干细胞。

间充质干细胞移植

在临床移植学中，人类间充质干细胞可用于确保造血干细胞及其早期分化后代的扩增。尤其值得一提的是，在接受高剂量化疗的癌症患者中，引入自体造血干细胞和间充质干细胞 (MSC) 可加速恢复外周血中中性粒细胞和血小板的数量。异体和自体间充质干细胞移植可用于治疗多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血和自发性血小板减少症——这些疾病与造血组织基质的原发性缺陷有关。在许多情况下，通过同时引入基质细胞和造血干细胞，肿瘤血液病理学中的细胞治疗效率更高，这表现为术后造血恢复时间的减少，由于区域和循环癌细胞的非选择性破坏而导致的致命结果的数量减少，其中患者自身的祖造血细胞也会死亡。 MSCs 和其他多能间充质祖细胞在临床实践中的应用前景是由于它们相对容易从骨髓抽吸物中获得、在培养中扩增和治疗基因的转染。同时，局部植入多能间充质祖细胞可用于补偿局部组织缺陷，并且在间充质组织出现系统性功能障碍的情况下，不排除将它们引入全身血液循环。

一些作者从基质细胞生物学的角度分析了间充质干细胞在局部、全身移植和基因治疗中的应用前景，他们的推理则更加谨慎。传统上，出生后的骨髓被认为是一个由两个主要系统组成的器官，这两个系统由明确的细胞系组成——造血组织本身和与之相关的支持基质。因此，骨髓间充质干细胞最初仅被视为产生造血微环境调节因子的基质基础来源。随后，研究人员的注意力转向研究间充质干细胞作为骨骼组织干细胞来源的作用。最新数据表明，骨髓基质细胞具有意想不到的分化潜力，可以形成神经组织或肌肉组织。换句话说，间充质干细胞表现出跨胚层可塑性——能够分化成与原始组织细胞在表型上无关的细胞类型。与此同时，骨髓基质细胞的某些生物学特性，无论是从总体生物学角度还是从具体细节角度来看，都仍未得到清晰明确的解答，包括骨髓基质细胞的识别、性质、来源、体内发育和功能，以及其体外可分化潜能和体内治疗用途的可能性。关于间充质干细胞（MSC）潜能的数据以及关于其他干细胞再生潜能的研究结果，与生物学既定的教条截然相反。

低密度培养时，骨髓基质干细胞会形成不同的集落，每个集落均源自单个祖细胞。有核骨髓细胞中基质祖细胞的百分比由集落形成能力决定，高度依赖于培养条件和间充质干细胞（MSC）种类。例如，在啮齿动物中，培养物中必须存在经辐照的骨髓滋养层细胞和血清才能获得最大数量的基质祖细胞；而在人类中，间充质干细胞的集落形成效率与滋养层细胞和培养基无关。已知的刺激基质祖细胞增殖的促有丝分裂因子数量有限，包括血小板衍生生长因子 (PDGF)、表皮生长因子 (EGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)、转化生长因子-β (TGF-β) 和胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)。在最佳培养条件下，多克隆MSC系在体外可承受超过50次细胞分裂，因此可以从1毫升骨髓基质干细胞抽吸物中获得数十亿个骨髓基质细胞。

然而，骨髓基质细胞群是异质性的，表现为菌落大小各异、形成速度不同，细胞形态也多种多样，从成纤维细胞样梭形到大型扁平细胞。在这种培养物的发展过程中，20天后也会注意到表型异质性。一些菌落以碱性磷酸酶高表达为特征，而另一些则根本不表达，第三种类型的菌落中心区域为磷酸酶阳性，周边为磷酸酶阴性。单个菌落形成骨组织结节（基质矿化的开始以茜素红染色或根据 Van Koss 的钙染色为标志）。在其他菌落中，会发生脂肪堆积，通过油红 G 染色识别。间充质干细胞菌落较少形成软骨，用阿尔新蓝染色）。

异位移植到实验动物体内后，多克隆MGK细胞系会形成异位骨，该骨具有与髓系细胞生成和脂肪细胞相关的网状基质，以及较少见的软骨组织。当移植骨髓基质细胞单克隆系时，在某些情况下会观察到嵌合现象，即新生骨由骨组织细胞组成，包含供体来源的基质和脂肪细胞，而造血细胞系和血管系统的细胞则来自受体。

这些研究结果证实了克隆系来源的骨髓基质祖细胞的干细胞特性。它们还表明，并非所有在培养中形成克隆的细胞都是真正的多能干细胞。一些研究人员认为，关于单个克隆的真正分化潜力的最可靠信息只能在移植后在体内获得，而不是通过在体外确定其衍生物的表型来获得，我们也同意他们的观点。培养中骨、软骨或脂肪形成的表型标志的表达（由 mRNA 或组织化学技术确定）甚至矿化基质的产生都不能反映单个克隆在体内的多能性程度。因此，只能在适当的生物移植试验条件下，事后在一组基质细胞中识别干细胞。尤其是在开放式移植系统中，软骨形成非常罕见，而在封闭式系统（例如扩散室或基质细胞体外微团培养）中，软骨形成却屡见不鲜。在这些封闭式系统中，局部氧张力较低，从而促进软骨组织的形成。因此，即使是移植技术以及非特异性的体外培养条件，也会显著影响MSC的分化范围。

在特定实验条件下进行实验性移植是确定骨髓基质细胞分化潜能的金标准，也是鉴定骨髓基质细胞的关键因素。从历史上看，骨髓基质细胞移植研究与骨髓移植的一般问题相关。已确定造血微环境是通过移植骨髓基质细胞系创建的，并在移植区域提供造血组织的异位发育。微环境来源于供体，造血组织来源于宿主，这使得我们可以将异位骨视为真正的“倒置”骨髓移植。骨髓基质细胞的局部移植可有效修复骨缺损，其效果比自发修复再生更为显著。多项临床前实验模型研究已令人信服地证明了骨髓基质细胞移植在骨科应用的可能性，尽管即使在最简单的病例中，也需要最细致的工作和分析来优化这些方法。特别是，成骨基质细胞体外扩增的最佳条件尚未确定，理想载体的结构和组成，以及骨体积再生所需的细胞数量也尚未确定。

除了利用体外扩增的骨髓基质细胞再生间充质来源的组织外，间充质干细胞 (MSC) 的非常规可塑性也为神经细胞再生或向中枢神经系统递送基因产物开辟了潜在的应用前景。原则上，这简化了神经系统损伤的细胞治疗，因为无需获取自体人类神经干细胞。已有报道称，骨髓细胞可用于生成心肌细胞和成肌祖细胞（包括真正的基质来源和基质外来源）。

目前，针对常见骨骼疾病的治疗，正在进行骨髓基质细胞系统性移植实验。毫无疑问，骨髓基质细胞是骨骼疾病遗传性疾病的致病细胞群，这可以通过利用这些细胞作为遗传信息载体进行转移，从而导致实验动物病理性骨组织的形成得到充分证明。然而，基质细胞进入全身血液循环后，能否在骨骼中植入、移位、增殖和分化尚未得到证实。

部分原因在于，在标准骨髓移植中，基质细胞并非与造血组织一起移植，因此尚未制定严格的标准来评估全身性应用的基质细胞是否成功植入。需要注意的是，组织提取物中存在标记基因或在培养中分离供体来源的细胞并不代表细胞已植入，而仅代表其存活。即使将骨髓基质细胞经动脉注射到小鼠肢体中，也几乎不会发生植入，尽管骨髓微血管中存在大量供体来源的细胞。遗憾的是，通常仅根据在体外培养中检测到供体细胞的标记基因就将此类细胞描述为“已植入”。此外，必须提供确凿的证据，证明已分化且功能活跃的供体来源细胞已在研究组织中长期整合。在众多已发表的关于骨髓基质细胞在骨骼中植入的论文中，令人震惊的是，缺乏此类清晰的数据。然而，值得注意的是，一些正确的动物实验确实证实了基质祖细胞在系统性给药后确实存在有限但真实的植入。

这些数据与关于通过血管系统将骨髓成肌祖细胞输送至肌肉的可能性的研究结果一致。然而，不应忘记，骨骼和肌肉组织都是在发育和生长过程中形成的，其形成基于血管外细胞运动，这种运动采用不涉及血液循环的迁移过程。如果存在将祖细胞输送至固相组织的独立循环途径，那么是否可以假设存在生理循环的间充质祖细胞？这些细胞在发育和出生后的生物体中的来源是什么？它们是如何穿透血管壁的？这些问题的解决似乎是绝对必要的，需要进行最细致的临床前分析。即使找到了这些问题的答案，与骨骼生长和结缔组织重塑相关的复杂动力学问题仍将悬而未决。同时，通过用健康的基质成分替换所有突变的骨骼祖细胞来治疗成骨疾病似乎具有切实的临床前景。在这种情况下，病理性成骨导致的局部骨折区或变形，以及骨组织的破坏性改变，可以通过体外培养的基质干细胞进行修复。因此，未来研究应重点关注自体突变成骨祖细胞的体外转化或基因校正问题。

细胞基因工程，无论是短期还是长期的，都已成为细胞和分子生物学的基础，也是许多关于单个蛋白质在体内和体外细胞代谢中作用的科学发现的源泉。利用分子技术矫正遗传性病理和人类疾病对实用医学有着巨大的前景，因为骨髓基质干细胞的特性使得开发独特的移植方案来矫正骨骼遗传性疾病成为可能。同时，间充质前体细胞易于从未来的接受者体内获取，它们易于进行基因操作，并能够在短时间内大量增殖。使用间充质干细胞可以避免通过血管内载体构建体直接向患者递送遗传信息物质所带来的局限性和风险。类似的策略也适用于胚胎干细胞，但自体出生后的骨髓基质细胞是更理想的材料，因为导入这些细胞可以避免移植后可能出现的免疫并发症。为了达到短期效果，例如加速骨再生，最佳方法是使用电穿孔、化学融合、脂质体转染、质粒和腺病毒载体对间充质干细胞进行基因改造。具体而言，病毒转染骨髓基质细胞BMP-2已被证明可有效加速实验性多发性创伤中的骨再生。由于无毒性，构建腺病毒载体载体是更可取的。然而，在这种情况下，骨髓基质细胞的基因改造具有极低的稳定性。此外，正常转化的骨髓基质细胞需要使用比其他细胞类型高10倍的遗传信息载体，这会显著增加转染细胞的死亡率。

治疗由某些基因低生物活性或零生物活性引起的隐性疾病需要对间充质干细胞进行长期或永久性改造，这需要使用腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒或腺逆转录病毒嵌合体。这些病毒的转运区能够转移较大的 DNA 转染物（最大 8 kb）。科学文献已经报道了转染了逆转录病毒构建体的骨髓基质细胞的外源生物活性，这些逆转录病毒构建体编码了调节和标记分子（IL-3、CD2、因子 VIII）以及参与 L-DOPA 合成的酶的合成。然而，即使在这些研究中，作者也指出了在实际应用该技术之前需要克服的一些限制。第一个问题是优化体外 MSC 改造的过程。已知骨髓基质细胞在体外长期（3-4 周）增殖会降低其转染。同时，为了实现间充质干细胞（MSC）的高水平基因改造，需要进行多个转染周期。第二个问题与治疗性基因表达的持续时间有关，目前该持续时间不超过四个月。有效基因表达的自然下降是由于启动子失活和修饰细胞死亡造成的。鉴于利用间充质干细胞转移遗传信息的广泛前景，初步研究结果表明，需要进一步优化体外转染方法，选择合适的启动子以调控所需方向的生物活性，并提高修饰后的骨髓基质细胞在移植后体内的自我维持能力。需要注意的是，使用逆转录病毒载体以所需方向修饰骨髓基质细胞并不总是需要强制植入。转染的间充质干细胞可以在稳定驻留的背景下发挥矫正功能，而无需在结缔组织中强制进行主动物理整合和功能。在这种情况下，它们应该被视为一种生物微型泵，在体内产生一种因子，其缺乏决定了遗传病理的表现。

使用转化的骨髓基质细胞治疗显性遗传病（其特征是表达具有病理性或异常生物活性的基因）更加困难，因为在这种情况下必须阻止扭曲遗传信息的转移或实施。基因工程的方法之一是对胚胎干细胞进行同源重组，以创造转基因动物。然而，即使开发出新的技术方法，极低的同源重组程度加上此类重组体的识别、分离和扩增问题也不太可能在不久的将来促进该方法的广泛应用。显性病理基因治疗的第二种方法基于受损 DNA 的自动修复，因为可以通过引入具有所需序列的外源 DNA（短 DNA 寡核苷酸或嵌合 RNA/DNA 寡核苷酸）来纠正基因突变，该外源 DNA 可与受损基因组中的同源物结合。第三种选择涉及阻止病理信息的传输，这是通过使用专门设计的寡核苷酸来实现的，这些寡核苷酸与特定基因结合形成三元螺旋结构，从而消除转录的可能性。

尽管在基因组水平上纠正遗传疾病仍然是最理想和最优选的治疗方法，但mRNA也是阻断显性负基因的一种有前景的载体（甚至可能更容易获得）。长期以来，人们一直使用含有反义寡核苷酸或完整序列的蛋白质分子来阻断mRNA与细胞生物合成装置结合，以抑制翻译和/或增加mRNA降解。此外，双链RNA会诱导mRNA快速降解，其机制尚不清楚。然而，仅仅消除由短突变或单突变突变等位基因转录的mRNA不太可能促进正常等位基因mRNA的表达。另一种方法是使用锤头状和发夹状核糖合成酶，它们能够与mRNA的高度特异性区域结合，随后在翻译过程中诱导其裂解和失活。目前正在研究将该方法用于治疗病理性成骨的可能性。无论目标究竟是什么——基因组或细胞质元素，新基因治疗技术的成功将取决于试剂在体外骨髓基质细胞中的纳入效率、特定载体的最佳选择以及间充质干细胞在体内稳定表达必要因子的能力。

因此，间充质干细胞及其意外特性的发现，为细胞系的开发提供了一个新的概念方案。然而，仍需进一步开展跨学科研究，以了解间充质干细胞的生物学作用、其性质、其转分化或去分化能力，以及其在胚胎发育、出生后生长、成熟和衰老过程中以及在人类疾病中的生理意义。