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結核病的實驗室診斷

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最近審查:11.04.2020
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結核病是一種在現代條件和科學成就中易於診斷的疾病。結核病的實驗室診斷是其他診斷方法的核心,僅次於X射線研究方法。

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臨床驗血

在肺結核患者中,一般血液分析的變化不是特徵性的。在它們的正常數量的限制,無活性形式的紅細胞的結核低色素特性。當大量浸潤或乾酪性肺炎,而乾酪性淋巴結炎,特定的腸道病變,以及為大型肺部或術後出血及注意事項紅細胞減少microcytosis,oligohromaziyu,polihromaziyu的患病率。通常伴有嚴重的貧血,特別是黃體細胞增多症,尤其是poikilotsitoz。在步驟結核網織紅細胞數補償的範圍從0.1至0.6%,其中subcompensated - 從0.6到1.0%和1%的特徵在於,網織紅細胞代償。

當結核在某些情況下可能有中度白細胞增多(高達15000白細胞。),較少的輻射,這發生在患者的有限和容易的過程存在的形式和在12.5%2-7% - 通過破壞性和漸進肺結核。

最常見的變化發生在白血球配方中。標記相對和絕對嗜中性粒細胞,在早幼粒細胞之前將白細胞公式適度移向左側。在沒有並發症的結核病情況下,髓細胞非常罕見。增加與haemogram結核病患者晶粒異常的中性粒細胞的數量總是指示過程的持續時間:重症肺結核幾乎所有的嗜中性粒細胞含有異常晶粒。當結核爆發停止時,核轉移相對較快地接近正常。嗜中性粒細胞的病理粒度通常比血像中的其他變化持續更長時間。

嗜酸性粒細胞在外周血中的含量也隨著過程的階段和生物體的過敏狀態而變化。它們的數量減小,直到在疾病的嚴重和長期爆發aneozinofiliya,並且相反地,隨著吸收浸潤和胸腔積液,以及初級結核病的早期形式。

大多數形式的原發性結核伴有淋巴細胞減少,有時甚至觀察到幾年後,甚至在特定變化形成疤痕後。繼發性結核病在惡化階段取決於過程的嚴重程度,可伴有正常數量的淋巴細胞或淋巴細胞減少症。

它佔有特殊的位置確定血沉附加測試以評估結核處理(ESR),其具有在評價流動結核過程以及識別其活性形式的值。增加ESR表示的病理過程(感染性炎症,化膿性感染性,hemoblastosis,霍奇金等人)的存在和指示它的嚴重程度,但正常水平ESR並不總是表明不存在病理狀況。血球中球蛋白,纖維蛋白原,膽固醇含量的增加和血液粘度的降低有助於促進紅細胞沉降。減緩紅細胞沉降是伴隨血液濃縮狀態,白蛋白和膽汁酸含量增加的狀態的特徵。

治療期間結核病患者的血像變化。血液學改變消失得越快,治療干預越成功。但是,應該記住對各種抗菌藥物的造血作用的影響。它們經常引起嗜酸性粒細胞增多,在一些情況下 - 白細胞增多症,更常見的是白血球減少症,直到粒細胞缺乏症和淋巴網狀反應。對獲得的數據進行系統的血液學控制和正確分析對於評估患者的臨床狀態,過程的動態和所用治療的有效性至關重要。

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尿液的臨床分析

對於泌尿系統結核,尿分析是主要的實驗室診斷方法。您可以觀察白細胞尿,紅細胞尿,蛋白尿,低血糖,結核分枝桿菌,非特異性菌尿。

Leucocyturia - 前化療並沒有具體的,只有在特殊情況下,如輸尿管管腔完全閉塞泌尿系統結核最常見的症狀。Nechyporenko測試(判定1毫升的尿液白細胞的數目)有助於更客觀地評估與程度leukocyturia nefrotuberkuloze,並且在一些情況下,在正常尿分析識別它。但是,必須考慮到白細胞尿症可能發生在急性和慢性腎盂腎炎,膀胱炎,尿道炎,腎和輸尿管結石。

Eritrotsiturii。以及白細胞尿。被認為是泌尿生殖系統結核病最常見的實驗室徵兆之一。血尿的頻率取決於過程的流行程度,隨著腎臟中破壞性結核病進程的增加而增加。沒有白細胞尿的紅細胞尿症在腎結核早期更為典型。血尿主要是白細胞尿,是腎結核與非特異性腎盂腎炎分化的重要論據。

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生化血液檢測

對於肺結核,一些生化參數的變化主要取決於該過程的階段,並發症和各種伴隨疾病。對於肺和其他器官非活動性肺結核患者,血清總蛋白和蛋白組分不變並確定其正常含量。

在該疾病的急性形式中,以及慢性形式的結核病的惡化和進展,白蛋白 - 球蛋白係數降低。

必需在評估結核及其並發症器質性損害和肝的功能狀態是血清總,直接膽紅素,AST(ACT),谷丙轉氨酶(ALT)的確定。動態測定氨基轉移酶水平。膽紅素肺結核患者的治療,尤其是在嚴重的形式, - 的結核病患者的生化檢查的強制成分,並按月進行。

根據Cockcroft-Gault公式,評估腎臟的功能狀態包括測定血清肌酸酐和計算腎小球濾過率。使用Reberg's樣本計算腎小球濾過率會得到較不准確的結果。

結核病患者動態生化研究的主要目標是監測過程的進程,及時發現藥物的副作用並適當糾正出現的穩定性疾病。

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生化法在肺外結核中的應用

最具指導性的指標是生物體液中結核硬脂酸的含量,但其定義與技術困難(對氣相色譜和質譜的需求)有關。

前瞻性測量腺苷脫氨酶活性 - 一種在液體中測定的酶:滑膜,心包,腹水或脊髓。腺苷脫氨酶的主要生產者是淋巴細胞和單核細胞。生物體液中腺苷脫氨酶活性的測定有助於診斷結核性滑膜炎,淋巴結結核,結核性腦膜炎,結核性漿膜炎。

由於其非特異性,某些生化指標僅在生物體液中確定,靠近病灶焦點。測量響應於皮下或皮內註射結核菌素(通常在其之後48小時和72小時後)的指標水平。之後,相對於初始水平計算標記水平的增加程度(以%表示)。

轉氨酶的器官特異性酶的活性的尿中最佳測定,其出現在各種性質的腎的失敗中註意到。只有在皮下注射結核菌素的條件下加強轉氨酶的研究才能加劇局部炎症過程。首先確定尿中轉脒的活性,並在引入50個TE結核菌素後24-72小時。增加2倍以上的鐵質含量可使82%的病例區分活動性腎結核和慢性腎盂腎炎的惡化。

對於女性生殖器官的結核病,血液中觸珠蛋白和丙二醛的濃度在挑逗性結核菌素試驗的條件下測定。以50TE的劑量皮下注射結核菌素並在72小時後進行第二次生化研究。在結核病因病例中,觸珠蛋白水平增加的程度不低於28%,丙二醛水平為39%或更高。還使用從Douglas空間獲得的腹膜液中腺苷脫氨酶活性的測定。在0.1 TE和0.01 TE的劑量下,將結核菌素皮內註射到前腹壁的內生殖器的投影中72小時後重新檢查點狀物。贊成結核病的過程中,腺苷脫氨酶的活性與最初的相比增加10%或更多。

當眼睛受到影響時,檢查響應於抗原刺激的眼中發生的局部反應。不希望發生明顯的反應,伴隨著視覺功能的下降。由於最小局灶反應的評估往往很困難,因此對於結論的客觀化,建議平行定位並根據血清珠蛋白或腺苷脫氨酶的生長程度進行定位。

所有的生化研究都應該與其他方法一起進行。

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血液凝固系統研究

結核病的血液凝固系統的研究現狀相關性是由許多的患者在手術治療肺結核的肺結核咯血或肺出血,以及hemocoagulation並發症的存在而引起的。另外,自然伴隨肺結核的血管內血液凝固潛流影響疾病的進程和化療的有效性。

在患者的血液中抗凝血活性明顯下降,滲出性炎症成分的肺結核患病率。患者肺中的特定的病灶具有略微表達的生產性血管內hemocoagulation炎性成分的佔優勢的低發病率。對於伴有咯血和肺出血狀態的血液凝固系統肺結核不同的是:患者的高度gemoptoe或之後的終止低失血有凝血能力急劇增加,由於trombinoobrazovaniya的嚴重激化,同時保持增加的“結構”凝結。在患者大量失血觀察到降低纖維蛋白原濃度為代價降低凝血潛力。因子XIII活性,血小板計數。在手術治療的患者有顯著違反系統的動態平衡發生肺結核有限形式的階段。患者在pnevmon-或plevropnevmonektomii執行廣泛的過程中經常開展DIC,可以採取的形式“第二種疾病。”

為監視與肺結核應進行判斷的活化部分凝血激酶時間(aPTT),纖維蛋白原,凝血酶時間,凝血酶原指數和出血時間和凝血時間凝血的患者的狀態。

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荷爾蒙研究

現代實驗和臨床觀察表明在特定的結核性肺部炎症中存在激素狀態的變化。它證明了垂體 - 腎上腺,腦垂體,甲狀腺系統的功能障礙和胰腺功能與抗結核療法聯合的校正在一個基因座特異性炎症向纖維化和修復的激活。

垂體-甲狀腺系統的功能狀態通過三碘甲狀腺氨酸(T的血清中的內容判斷3),甲狀腺素(T 4),垂體促甲狀腺激素(TSH)。結果發現,亞臨床甲減是在肺結核患者38-45%檢測,最常被診斷為播散和成纖維海綿狀形式的過程。在這些相同的形式最顯著地減少雙方的T水平3和T 4,並且存在來自這些激素的不平衡增加T的比的形式4 / T 小號

腎上腺皮質功能由皮質醇的血清中的水平,和胰腺的內分泌功能評價 - 免疫反應性的胰島素的濃度。在傳染病的急性階段,對內源性皮質醇和胰島素的需求增加。高胰島素血症也證明身體組織的胰島素抗性,這對任何活性炎症過程都是典型的,特別是特異性的。活動性肺結核測定glyukokortiko idnoy腎上腺功能顯示庫欣的大多數患者的存在。在急性期與感染性炎症患者血液皮質醇濃度的正常水平應被視為腎上腺皮質,可以作為用於保持劑量的糖皮質激素的適當替代療法的基礎的糖皮質激素功能的相對失敗。

幾乎三分之一的肺結核患者可以確定其中的胰島素血症水平很低,接近常模的下限,而13-20%的患者觀察到顯著的高胰島素血症。相對低胰島素和高胰島素血症都是不同程度侵犯碳水化合物代謝的高危因素。胰腺B細胞功能活動的這些變化需要定期監測結核病患者的血糖,並及時預防糖尿病。另外。這為在結核病複雜治療中使用生理劑量的胰島素的便利提供了額外的理由。

在一般情況下,較低水平的甲狀腺激素及其不平衡高皮質醇血症和高胰島素血症最大範圍的患者結核過程中嚴重的過程中,具有廣泛的肺損傷和中毒肺結核症狀嚴重的。

結核病的微生物學診斷

從註冊表中取出之前需要在患有結核病,診斷的驗證,監測和化療校正評估治療結果,換言之,識別微生物學研究中,由於患者結核病的登記。

所有的流行病學計劃和項目都是基於對細菌排泄物數量的評估,如果不使用實驗室方法檢測結核分枝桿菌,這是無法完成的。在對所謂無組織人口的調查中,細菌侵入者的比例達到70以上,這使得實驗室方法成為這一人群中結核病患者識別的一種充分有效的手段。

傳統的用於診斷結核病的微生物學方法是細菌學和文化研究。現代方法考慮在自動系統中培養結核分枝桿菌,設置PCR。但是,所有這些方法都必須結合傳統的細菌學方法。

診斷材料的集合

實驗室研究的有效性在很大程度上取決於診斷材料的質量。遵守診斷材料收集,儲存和運輸規則以及患者評估算法的確切實施直接影響結果並確保生物安全性。

為了測試結核病,使用了各種材料。由於這樣的事實,TB logkih-最常見的一種病變結核,基礎材料研究考慮痰和其他類型的可分離氣管支氣管的:霧化吸入後獲得的上呼吸道分泌物:支氣管灌洗液; 支氣管肺泡沖洗液; 從支氣管吸出物,喉拭子,從傷口和塗片人排泄物通過支氣管鏡檢查獲得的材料,並經氣管肺內活檢。

如果從患者身上收集受控的材料,研究的有效性會提高。為此目的,分配特別配備的房間或購買特殊的出租車。材料的收集是一個危險的程序,因此有必要收集研究材料,遵守傳染性安全規則。

用於測試結核分枝桿菌的材料收集在無菌瓶中,並帶有擰緊螺帽,以防止污染環境並保護收集到的材料免受污染。

用於收集診斷材料的樣品瓶必須符合以下要求:

  • 必須由抗衝擊材料製成;
  • 在高壓滅菌過程中應該很容易融化;
  • 足夠的體積(40-50毫升):
  • 痰液採集口徑大(直徑不小於30mm);
  • 易於處理,透明或半透明,這樣您就可以在不打開蓋子的情況下評估收集的樣品的數量和質量。

為了獲得最佳的研究結果,必須遵守以下條件:

  • 化療開始前收集材料;
  • 必須在早晨攝入食物和藥物之前收集研究材料;
  • 為了研究,最好收集至少3個早晨痰樣。痰連續3天;
  • 收集到的材料必須盡快送到實驗室:
  • 在不能將材料送至實驗室的情況下,將其在4℃的空氣溫度下保存在冰箱中不超過48小時;
  • 運輸物料時,有必要密切監控小瓶的完整性。

正確收集痰是粘液或粘液膿性的。測試痰的最佳體積是3-5毫升。

痰在醫學專業人員的監督下收集。負責痰液採集的人員應遵循下列規定:

  • 有必要向患者解釋研究的目的和需要咳嗽而不是唾液或鼻咽粘液,而是深呼吸道內容物。這可以通過幾次(2-3)深呼吸後產生的咳嗽產生。還有必要警告病人,他應該用開水沖洗他的嘴,除去口腔中生長的微生物群的主要部分和妨礙檢查痰的食物殘留物;
  • 一名參加痰液收集的醫務工作者,除了一件浴袍和一頂帽子外,還必須戴口罩,橡膠手套和橡膠圍裙;
  • 站在患者後方,建議保持瓶盡可能接近他的嘴唇,立即分開他排痰,因為它,因此它需要提供的氣流從衛生保健提供者背離的:
  • 痰液收集完成後,衛生工作者應小心地蓋上瓶蓋並評估收集的痰液的數量和質量。然後將瓶子貼上標籤並放入特殊的bix中以運送到實驗室。

或者使用安裝在機房設備收集應用刺激性吸入 - 如果患者不前,並在必要時給予他祛痰:.棉花糖(mukaltin),溴己新,鹽酸氨溴索等的根的提取物材料的收集日清晨產生痰,夜痰。以這種方式收集的材料不受保護,應在收集當天進行檢查。為避免其在實驗室的“撲殺”方向應該做出特殊的標記。

如果微生物學研究沒有在這個設施進行,收集到的診斷材料應該集中交付到實驗室,只要材料在冰箱內交付或使用防腐劑之間保存。運送箱內的材料可以很容易地消毒。每個樣品應提供適當的標籤,整個批次應填寫隨附的表格。

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患者檢查的模式和頻率

在對結核病患者進行最初的所謂診斷性檢查時,有必要檢查至少3個痰部位2或3天。在醫務人員的監督下收集,這提高了顯微鏡的有效性。

初步的結核病篩查應由衛生保健系統的所有醫療診斷機構進行。最近,在臨床診斷實驗室的基礎上組織了所謂的配備有現代顯微鏡和流行安全設備的顯微鏡中心,以提高初步檢查的效率。

在抗結核病設施中,使用包括痰檢查或其他診斷材料在內的篩查測試3天至少3次。在治療期間,微生物研究在強化療期間每月至少定期進行一次。在向治療階段過渡時,研究的進行較少 - 間隔2-3個月,而研究的頻率減少到兩個。

用於肺外結核的診斷材料的特徵

設有TB的肺外形式病理材料 - 結核分枝桿菌的低濃度在它,這需要微生物學研究的更靈敏的方法,主要是在播種技術平台。

在泌尿生殖系統的結核病中,尿液是最容易接近的研究材料。尿液採集應該由經過專門培訓的護士完成。

用肥皂或高錳酸鉀弱溶液將外生殖器用水洗滌。小心處理尿道的外部開口。在無菌小瓶中,收集早晨尿的平均部分:男性,自然地,在女性中,使用導管。尿液從腎盂收集在一個或兩個腎臟插管的無菌管中,在後一種情況下 - 必須與每個腎臟分開。將少量這種尿液離心,檢查沉澱物。

在男性,精子,點狀睾丸,前列腺的秘密進行離心獲得沉澱。隨著男性生殖器區域的特定過程的任何定位,前列腺按摩可促進含有結核分枝桿菌的分泌物的分泌。

通過吮吸或使用卡夫卡帽來收集婦女的月經血。將所得物質從紅細胞中除去,用蒸餾水洗滌,然後離心。檢查沉澱物。

子宮頸管內的分配採用一些卡夫卡容量或瓶蓋進行收集,也就是說,最好積聚1-2ml病理物質。

通過手術干預腎臟,生殖器獲得的材料。用活檢,從子宮內膜刮出,均質化。為此,將其置於無菌砂漿中並用無菌剪刀徹底粉碎。向該漿液中加入無菌河砂的量等於其重量,然後加滿0,5-1.0毫升等滲氯化鈉溶液,和一切研磨直到添加等滲氯化鈉溶液(4-5毫升)的糊狀物質。然後使物質靜置1-1.5分鐘,檢查上清液。

骨骼和關節結核。用無菌注射器獲得的點狀(膿腫膿液)置於無菌皿中並立即送至實驗室。無菌移液管,先前用無菌等滲氯化鈉溶液潤濕,取2-5毫升膿液,將其轉移到一瓶珠子中,再加入2-3毫升等滲氯化鈉溶液。瓶子用軟木塞封閉,並在小丑裝置中搖動8-10分鐘。檢查均化的懸浮液。

在骨關節結核的瘻管中,從瘻管中取出膿液。大量排放物直接收集到試管中。在箱子用無菌等滲氯化鈉溶液稀膿溢瘺,和洗滌液收集到一個試管中,或用於分析發送的片棉塞與膿浸漬的。

在對骨和關節進行手術干預期間獲得的手術材料可以由膿性壞死物質,顆粒,瘢痕組織,骨組織,滑膜組織和其他基質組成。它的治療是在腎臟的結核中進行的。

穿刺後立即進行3%檸檬酸鈉溶液(1:1比例)中的滑液以防止凝血的微生物學研究。

淋巴結結核。還檢查了在淋巴結穿刺過程中抽出的膿液。作為膿瘡的膿液。與其他形式的結核病一樣,檢查手術介入,活組織檢查中獲得的淋巴結組織。

由於幾乎完全缺乏陽性結果,因此對結核分枝桿菌糞便的研究極為罕見。

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分枝桿菌顯微鏡

痰顯微鏡是一種相對快速,簡單和廉價的方法,應該用於疑似結核病的所有病例。此外,本研究旨在評估化療的有效性,並確定如果沒有培養試驗,治療的恢復或失敗。

使用兩種顯微鏡檢查方法:

  • 直接顯微鏡檢查方法,直接從診斷材料中製備塗片;
  • 用去污劑處理過的材料製備的沉澱物的顯微鏡法。

第一種方法用於只進行顯微鏡研究的實驗室(普通醫療網絡的臨床和診斷實驗室)。

通過濃縮診斷材料(例如通過離心)獲得顯微鏡檢查的最佳結果。

進行顯微鏡檢查時,以50%的概率檢測結核分枝桿菌,1毫升痰液中應含有5000多個微生物細胞。肺結核病患者的痰中通常含有大量耐酸細菌,這些細菌可以通過細菌學檢查可靠地檢測到。這種方法的診斷靈敏度可以通過檢查一名患者的幾個痰樣本來改善。顯微鏡檢查的陰性結果,因為有些患者痰中含有較少分枝桿菌比可以通過顯微鏡檢測不排除結核的診斷。痰塗片的準備不充分也可能導致細菌檢查的陰性結果。

根據Tsiol-Nelsen的方法,檢測塗片中耐酸分枝桿菌的最常用方法是彩色的。該方法基於碳質品紅通過包含蠟質脂質層的膜滲入微生物細胞,同時加熱和強烈的苯酚的蝕刻作用。隨後用25%的硫酸溶液或3%鹽酸溶液變色可導致所有非耐酸結構變色。塗片的變色元素用0.3%的亞甲藍溶液染色。分枝桿菌不能感知通常的苯胺染料,因為耐酸分枝桿菌染成深紅色,而其他微生物和細胞元素則呈藍色。

為了研究Tsilyu-Nelsen染色的塗片,使用具有浸入物鏡(90或100倍放大率)和放大7或10倍目鏡的雙目顯微鏡。探索100個視野,這足以識別塗片中的單個分枝桿菌。如果這種研究的結果是否定的,為了確認,建議查看另外200個視野。記錄結果,顯示檢測到的抗酸桿菌的數量(KUM)。

除了這種技術之外,彩色熒光染料被用於發光顯微鏡,這可以實現最佳結果。這種方法的使用使顯微鏡的效率提高了10-15%。當用發光染料(金胺,若丹明等)處理分枝桿菌時,這些物質也會結合微生物細胞的蠟狀結構。當用激發光源(某種紫外線輻射)照射彩色細胞時,它們會在黑色或深綠色背景上開始發出橙色或亮紅色光。由於可見光圖像的亮度和對比度較高,顯微鏡的整體放大倍數可降低4-10倍,視野擴大,準備時間縮短。隨著這一點,由於更大的景深,你可以增加研究的舒適度。

當使用熒光顯微鏡掃描相同的區域時,塗片顯著少於Tsiol-Nelsen染色的光學顯微鏡的時間。如果在一個工作日內顯微鏡檢查約20-25個這樣的塗片,然後在熒光顯微鏡的幫助下,他可以同時檢查60-80個以上的樣品。有經驗的顯微鏡學家知道,用金胺和羅丹明混合物染色細胞在某種程度上對於耐酸桿菌特異性,在這種情況下,它看起來像金色棒。腐生菌塗綠色。

熒光顯微鏡的方法的另一個重要優點 - 檢測改變分枝桿菌的能力,失去了不利因素的影響,其中包括強化化療,kislotousotoychivosti財產和與這種染色施樂Nelsenu連接未檢測的影響下。

熒光顯微鏡方法的缺點包括顯微鏡及其操作的成本相對較高。然而,在集中式或其他大型實驗室中,如果負載超過3個使用三個傳統顯微鏡的實驗室技術人員的標準,則使用一個熒光顯微鏡代替成本更低。

細菌學方法具有相當高的特異性(89-100%)。通過任何顯微鏡方法獲得的陽性結果約有97%得到了播種結果的明確證實。

應該指出的是,當對病理材料的塗片進行顯微鏡檢查時,不可能確定鑑定的耐酸分枝桿菌屬的種屬。顯微鏡方法允許僅在微生物的製備中的存在或不存在酸的,其可以通過存在於大量形態上類似於結核分枝桿菌複合nontubercular酸抗性微生物的性質來解釋給出意見。

顯微鏡的結果以半定量單位進行評估。

為了能夠比較不同顯微鏡方法的結果,引入了經驗係數。例如,為了比較用熒光染料染色的塗片的結果,數據研究光學顯微鏡(放大1000倍),它是必要的劃分由所述熒光顯微鏡檢測抗酸桿菌的數量,以250倍的倍率相應的係數 - 〜10, 450倍 - 4倍,630倍 - 2倍。

顯微鏡對肺外結核的特點

進行直接顯微鏡檢查,以及富集後製備的塗片的顯微鏡檢查,然後進行Tsiol-Nelsen染色或熒光染料。由於材料中分枝桿菌濃度低,因此塗片的直接鏡檢無效,因此使用富集方法更為合理。最有效的是離心。如果生物材料是粘性的,則使用離心並使材料同時均質化和液化,其使用具有3000g離心力和次氯酸鹽溶液的高速離心機進行。其他富集方法,如微浮選,目前尚未使用,因為形成了生物危害性氣溶膠。

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肺結核診斷的文化方法

播種方法或培養方法比塗片顯微鏡更敏感,並且與後者相比具有許多優點。它允許在檢測材料中檢測幾十種可行的分枝桿菌,並具有很高的診斷價值。當檢查新診斷或治療過的患者釋放少量分枝桿菌時,這一點尤為重要。

與顯微鏡相比,文化研究允許增加超過15-25%的結核病患者的數量,並且在疾病仍然適合治療時在早期階段驗證結核病。培養試驗的一個非常重要的優點是可以獲得可以鑑定和研究藥物敏感性,毒力和其他生物學特性的激髮劑培養物。

培養方法的缺點包括持續時間(材料的等待時間達到10週)。更高的成本,診斷材料處理的複雜性。

預診治療診斷材料的原則

傳統的微生物學方法不能用於進行結核病研究。這是由於這個事實。結核分枝桿菌生長非常緩慢,大多數臨床樣品含有快速生長的化膿性和腐敗性微生物,真菌。它們在富營養培養基上的快速生長干擾了分枝桿菌的發育,並且不允許分離結核病的致病因子,因此診斷材料必須在播種前進行預處理。另外,從患者氣道釋放的分枝桿菌通常被大量粘液包圍,使得難以濃縮。在這方面,在種植痰和其他類似材料之前,它們的液化,去污是必要的。

所有的洗滌劑和去污劑對分枝桿菌都有或多或少明顯的毒性作用。作為處理的結果,高達90%的分枝桿菌可以死亡。為了保持足夠的分枝桿菌人口,節約需要使用,一方面處理技術,讓,以抑制快速增長的化膿性細菌和腐爛,並在其他 - 保存材料中存在的分枝桿菌的生存能力。

根據不同的材料,使用各種去污劑用於預處理的均勻性和污染它的程度:痰 - 4%的氫氧化鈉溶液,溶液trohzameschonnogo磷酸鈉10%,苯扎氯銨,磷酸三鈉,NALC-NaOH水溶液(N-乙酰基-L-半胱氨酸氫氧化鈉)以1%的NaOH的終濃度,在尿液和其它液體材料 - 硫酸溶液的3%,對於污染的樣品,含脂肪的材料 - 草酸的溶液至5%。另外,在一些情況下,使用酶,表面活性劑(去污劑)。應用吐溫清潔劑和其他一些分枝桿菌死亡伴隨著更少的細胞(40-50%存活)。但是,它們只能用於液體材料。世界上最大的分銷商是NALC-NaOH。成套出產。該方法允許分配超過85%的分枝桿菌細胞群。去污tkanesoderzhaschih固體更難猜測,因為該材料的分散體的均化過程中的困難程度。例如,淋巴結活組織檢查的治療通常伴隨著外來菌群污染的頻率增加。在這種情況下,可以使用1%的乙酮。

非均質材料在去污劑存在下與玻璃珠均化。液體材料被預先離心並且僅處理沉澱物。

播種和孵化技術

預處理後,將材料離心分離,從而沉澱分枝桿菌並增加其在沉澱物中的含量(“污泥富集”)。產生的沉澱物被中和,並用緻密的營養培養基或含有液體(半流體)培養基的管接種(接種)。從其餘的沉積物中,塗片準備用於顯微鏡檢查。播種技術應該防止診斷材料的交叉污染。

為了對微生物學研究的結果進行可靠的臨床解釋,必須遵守以下規則:顯微鏡和培養研究必須從診斷材料的同一樣品平行進行。

將接種的試管放置在37 的恆溫器中水平放置2天。這確保了材料更均勻地吸收到培養基中。2天后,將管轉移到垂直位置並用橡膠或矽膠塞密封,以防止播種介質乾燥。

作物在37℃ 左右下10-12週,每週定期觀察。對於每個預覽,記錄下列參數:

  • 播種生長當天視覺觀察的時期;
  • 增長率(CFU數量);
  • 農作物被外來的微生物菌群或真菌污染(這種管被除去);
  • 缺乏明顯的增長。管子留在恆溫器中直到下一次觀察。

營養媒體

各種營養培養基用於培養分枝桿菌; 緻密,半液體,液體。然而,沒有一種已知的營養培養基具有確保所有分枝桿菌細胞生長的特性。與此相關,推薦2-3種不同成分的營養介質同時使用,以提高效果。

世界衛生組織建議將萊文斯坦 - 詹森環境作為主要隔離結核病病原體和確定其藥物敏感性的標準培養基。這是一種緻密的雞蛋環境,在接種細菌學陽性物質後的第20-25天獲得了分枝桿菌的生長。細菌學陰性物質的作物需要更長的潛伏期(長達10-12週)。

在我國,擬議的E.R. 芬蘭雞蛋環境Finn-II。它的不同之處在於,它不使用L-天冬酰胺,而是使用谷氨酸鈉,其觸發其他合成分枝桿菌氨基酸的方式。這種培養基稍早出現生長,分枝桿菌的分配頻率比Lowenstein-Jensen培養基高6-8%。

為了提高肺外結核細菌學診斷的有效性,建議在營養培養基複合物中加入改良的Finn-II培養基。為了加速生長,另外向Finn-II營養培養基中添加0.05%降低氧濃度的巰基乙酸鈉。為了在Finn-II營養培養基中保護分支桿菌的酶系統免於脂質過氧化的毒性產物,添加濃度為0.001μg/ ml的抗氧化劑α-生育酚乙酸酯。診斷材料的播種按照標準程序進行。

在俄羅斯的抗結核實驗室中,使用了對密集營養介質的其他修改; 提議G.G. 由V.A.開發的Mordovian營養培養基“New”。Anicic營養培養基A-6和A-9等

由於這樣的事實,在化學療法的過程是微生物細胞的各種代謝系統損傷,一些分枝桿菌人口喪失在常規營養培養基中正常發展的能力和需要的滲透平衡(或半液態)培養基。

評估和記錄診斷材料的播種結果

一些分枝桿菌的菌株和種類生長緩慢,甚至在第90天時也會出現生長。這種作物的數量很少,但這可以在恆溫器中承受2.5-3個月的作物。

結核分枝桿菌的強毒培養物通常以密集的蛋環境生長,形式為各種大小和種類的R型菌落。菌落乾燥,起皺,象牙色,稍有色素沉著。在其他媒體中,結核分枝桿菌菌落可能更潮濕。在化療過程中或治療過程中,可以分配具有潮濕生長的光滑集落(S形式)。

在分離作物時,使用一系列特殊研究來區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌和耐酸腐生菌。

強化顯微鏡檢查染色的Tsiol-Nelsen塗片從生長的菌落後得到陽性反應。在塗片中分枝桿菌生長的情況下,發現明亮的紅色棒狀物,它們單獨或成組形成毛氈或辮狀物形式的簇。在年輕培養物,特別是從患者的化療長期治療中分離,分枝桿菌不同表達的多態性,直到存在桿狀,具有類似於菌絲短,幾乎球菌或細長的版本一起。

分枝桿菌的生長速率由以下方案表示:體外(+) - 1-20cfu(少量細菌排泄); (++) - 體外20-100 CFU(中等細菌排泄); (+++) - > 100 CFU體外(豐富的細菌排泄)。在結核病的實驗室診斷中,僅通過一種或另一種方法檢測分枝桿菌是不夠的。對分枝桿菌種群的範圍和性質,組成和性質有詳細的了解。正是這些數據使我們能夠正確解釋過程的狀態,計劃策略並及時糾正治療。

近年來,為了加速分枝桿菌的生長,已經提出了基於瓊脂的各種生長添加劑和使用特殊氣體混合物的營養培養基。為了在這些培養基上獲得分枝桿菌的生長,在培養期間,產生具有高含量二氧化碳(4-7%)的氣氛。特殊的CO 2 -孵化器用於此目的。然而,最發達的培養分枝桿菌的自動系統:MGIT-BACTEC-960和MB / Bact。

一種這樣的系統 - MGIT系統(分枝桿菌生長指示管),這是指高技術的發展和旨在用於結核分枝桿菌和易感性的快速細菌學診斷一線藥物,以及一些二線藥物。MGIT專注於將其用作VASTES-960器件的一部分。基於改良的Middlebrook-7H9培養基,在具有液體營養培養基的特殊試管中培養微生物。為了刺激分枝桿菌的生長並抑制外源微生物群的生長,使用MGIT生長補充劑和PANTA抗菌藥物的混合物。

光學記錄微生物的生長。它基於熒光,當生長過程中氧被分枝桿菌消耗時發生。氧氣依賴型熒光染料存在於特殊試管的底部,並覆蓋一層矽膠。再現分枝桿菌導致在管中氧的量的減少,並減少了導致熒光的增加,其通過紫外線照射管下變得可見,並自動註冊光傳感器內置器具VASTES-960的濃度。以增長單位(GU-生長單位)記錄發光強度。增長數據記錄在電腦中,可以自動保存。生長曲線的計算機分析可以提供多種分枝桿菌池,包括nontubercular存在信息,也有助於評估分枝桿菌的生長特性。

由於引入這樣的系統,分枝桿菌生長的時間顯著減少,平均在VASTES-960上11天,在MB / Bact上平均19天,在標準密集營養培養基上平均33天。應該指出的是,這些系統需要高素質的人員。液體介質播種材料將通過播改良羅氏培養基上,打的情況下替補的角色時,結核桿菌等媒體不允許成長護航。

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分枝桿菌藥物敏感性的測定

譜圖的確定和分枝桿菌對抗結核藥物的敏感程度具有重要的臨床意義,以及對耐藥結核病傳播的流行病學評估。此外,監測耐藥性可以評估整個肺結核方案的有效性,是防治結核病活動所有組成部分業績的一個完整指標。

藥物敏感性的倍數和時間:

  • 治療開始前一次確定治療的策略和策略:
  • 當從各種材料(痰液,BAL液,尿液,滲出液,液體等)的患病培養物中分離時,檢查所有分離的菌株:
  • 在沒有臨床和放射學動力學的治療強化階段結束時:
  • 如果在下列情況下需要改變治療方案:
    • 沒有痰塗片;
    • 痰塗片陰性後重新分離培養物;
    • 在初始下降後棉籤中CMU的數量急劇增加。眾所周知,結核分枝桿菌菌株在藥物敏感性方面是異質的,它們是從結核病患者的材料中分離出來的。菌株對抗結核藥物的敏感性可能在藥物譜,程度,頻率和耐藥性發生率方面有所不同。

結核分枝桿菌耐藥性的程度按照建立的標準,這是集中在臨床意義和穩定性取決於抗結核藥物,其藥代動力學,在病變濃度的活性來確定。最大治療劑量等。

目前通過微生物學方法進行分枝桿菌藥物敏感性的測定:

  • 絕對濃度(在緻密或液體營養培養基上的稀釋方法),
  • 比例,
  • 阻力係數。

通常,抗性表現為肉眼觀察到的結核分枝桿菌菌落生長的形式,但是有一些方法可誘導分枝桿菌細胞分裂早期階段以顏色反應形式生長。這些方法將測試時間從3-4週縮短到2週。

作為俄羅斯統一已經擴展,以絕對濃度的WHO委員會的化療方法,它是從方法論的角度來看建議,是最簡單的,但它需要高精度的實驗室程序標準化。藥物敏感性試驗由一組試管組成,其中營養培養基用抗TB藥物修飾。該組由2-3管與不同濃度的每種藥物的使用,一個控制管沒有藥物對環境和含1000微克/毫升鈉薩利tsilovokislogo或500微克/毫升paranitrobenzoynoy酸nontubercular來檢測分枝桿菌的生長一個管的。

為了製備具有製劑的一組培養基,使用改進的Levenstein-Jensen培養基(不含澱粉),將其倒入燒瓶中。在每個燒瓶中,加入特定體積的適當稀釋的抗結核製劑。將燒瓶內容物充分混合,倒入管中並在85℃的溫度下傾斜40分鐘折疊。建議使用自動溫度控制將介質纏繞在電動複捲機上。週三有抗結核藥物

1-st系列可以在2-4°C的冰箱中儲存1個月,第二排的準備工作 - 不超過2週。在室溫下儲存有製劑的介質是不可接受的。在製備抗結核藥物溶液時,要考慮它們的活性,計算調整製劑非特異性部分的分子量,純度等的濃度。為了確定藥物敏感性,只使用化學純物質。

該方法的原理是確定抑制大部分分枝桿菌群體生長的抗結核藥物濃度。如果做得對,這種方法具有很好的可靠性。

在測試之前,有必要確保孤立的結核分枝桿菌培養物沒有多餘的微生物群落。從0.9%氯化鈉溶液中的分枝桿菌培養物製備每毫升含有5億個微生物體的均勻懸浮液(5個單位的光學濁度標準)。所得漿液用0.9%氯化鈉溶液(1:10)稀釋,並將0.2ml漿液加入到該組培養基的每個管中。將種子管置於37℃的恆溫器中並保持2-3天的水平位置,以使培養基的傾斜表面均勻地接種結核分枝桿菌懸液。然後將管轉移到垂直位置並孵育3-4週。3-4週後記錄結果。

由於從營養培養基上的臨床材料中排泄排泄的時間至少為1-1.5個月,所以通過該方法確定藥物敏感性的結果可以在材料播種後不早於2-2.5個月獲得。這是該方法的主要缺點之一。

根據某些標準解釋確定分枝桿菌藥物敏感性的結果。固體培養基上被認為被包含在介質中的藥物的濃度敏感,如果在體外生長的這種藥物分枝桿菌的集落數是不超過20具有豐富的生長在控制管不用藥物。只有在超過20個殖民地的情況下,文化才被認為對這種濃度具有抵抗力。在實踐中,當在試管中獲得接近20cfu的增長結果時。有必要通知臨床單位,在這種情況下敏感性或抵抗性是臨界的,因為有時它可以解釋臨床指標的模糊動力學。

對於各種藥物,建立了一定的濃度,在該濃度下觀察到分枝桿菌群體臨界比例的再現。這些濃度被稱為“關鍵”。作為穩定性的標準,使用具有臨界濃度製劑的營養培養基上的分枝桿菌種群的生長。

在國內的結核病實踐中,在確定耐藥性時,它們並不僅限於確定臨界濃度。這是由於這個事實。該耐藥性的擴展定義級別允許臨床醫生能夠更準確地定位使用的增效藥物組合的作用的知識的戰術化療,交錯預期阻力或以施加更有效的藥物組使用抗結核藥。

絕對濃度法是最簡單的方法,但它對執行時的錯誤也是最敏感的。更可靠,特別是在確定對二線藥物的敏感度方面,俄羅斯境外常見的是比例方法。它考慮了絕對濃度方法的缺點,但在執行過程中更加費力。

該方法與絕對濃度法非常相似。以相同的方式製備含有藥物的試管。如絕對濃度法。然而,結核分枝桿菌懸浮液的種子劑量減少了10倍。其消除了某些結核分枝桿菌菌株對乙胺布特羅,丙硫異煙胺,捲曲黴素等藥物的自發耐藥頻率。作為對照,使用在試管中具有相同種子劑量的2或3個試管,其連續稀釋10倍和100倍。穩定性的標準是結核分枝桿菌肉眼觀察到的生長的比例。對於第一系列藥物,穩定性標準是初始種群的增長超過1%,對於第二排藥物,增加1或超過10%,取決於所選擇的臨界濃度。

1997年,世衛組織和國際聯盟的良好結核病耐藥結核病的鑑定工作小組作了調整這些標準,提供抗考慮分枝桿菌,其生長在固體培養基蛋羅氏濃度如下:

  • 雙氫鏈黴素-4μg/ ml;
  • 異煙肼0.2μg/ ml:
  • 利福平40μg/ ml:
  • 乙胺丁醇-2μg/ ml。

2001年,針對以下二線藥物(臨界比例為1%)提出臨界濃度:

  • 捲曲黴素-40微克/毫升;
  • protionamide - 40微克/毫升;
  • 卡那黴素-30μg/ ml;
  • 紫黴素-30微克/毫升;
  • 環絲氨酸40μg/ ml;
  • 氨基水楊酸-0.5μg/ ml;
  • 氧氟沙星-2μg/ ml。

作為初步和在培養6週後評估生長結果,作為最後一個。

為了確定吡嗪酰胺對結核病現代化療中廣泛使用的藥物敏感性,推薦臨界濃度為200μg/ ml。然而,仍是用於確定,因為它的抗菌活性的這種藥物在固體營養培養基的電阻沒有普遍接受的方法只在酸性介質中表現出(pH值<6),這在技術上是難以維護。此外,結核分枝桿菌的許多臨床培養物在酸性環境的卵子環境中不情願地生長。

為了評估分枝桿菌的藥物敏感性試驗的結果的質量,建議每一批新介質LJ的控制標準博物館菌株H37Rv的靈敏度的平行測定。此外,還必須保持某些微生物標準,以便該技術能夠提供良好的重現性和正確解釋的結果。這些包括結核分枝桿菌培養物的生存力,用於獲得的結核分枝桿菌,所選擇的細菌質量的代表性的選擇規則的均勻懸浮液,懸浮培養物的規則。耐藥性測定的可靠性隨著細菌釋放極其稀少而降低。

最近,使用自動化系統確定藥物敏感性的方法被認為是有希望的。這方面最完美的是基於VASTES MGIT-960的開發。在這種情況下,結核分枝桿菌的藥物敏感性是根據改良的比例方法確定的。在測定過程中,比較對照管和含有藥物的試管中的結核分枝桿菌的生長速率。為了確定對鏈黴素,異煙肼,利福平 - 皮脂素和乙胺丁醇的敏感性,使用了SIRE試劑盒中的富集補充劑和抗生素。要確定對吡嗪酰胺的敏感性,請使用PZA試劑盒。在懸浮試驗結核分枝桿菌接種的試管用藥物,以及所述控制管與重構懸浮除外吡嗪酰胺所有藥物的100倍,其中,所述懸浮液在10倍稀釋的過程。當在對照管400GU中生長時,穩定性的標準是100GU的分枝桿菌的生長指示物(參見“用於分離分枝桿菌的培養方法”)。結果的計算和解釋將自動執行,並由輸入或選定的程序進行設置。

作為臨界濃度,最終濃度用於具有液體營養培養基的試管中。目前,一線和二線藥物的臨界濃度已經形成。應該注意的是,結核分枝桿菌對環絲氨酸和氨基水楊酸的敏感性僅在雞蛋營養培養基上確定。

精細的工作協議描述的系統允許在研究藥物的敏感性為專用培養(密集營養培養基),並使用體外初級分枝桿菌MGIT生長。後一種選擇顯著減少了時間的文化,讓你從材料的收集之日起3週後得到結核分枝桿菌(包括對藥物的敏感性信息)的文化的全部結果,而有可能傳統的方法只獲得第3個月。及時,當患者處於強化治療階段時,所獲得的結果可以彌補相對較高的研究成本。

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分枝桿菌的分化

考慮到使用的營養培養基不是嚴格選擇性的。隨後的分離的分枝桿菌的分化被認為是強制性的。需要分枝桿菌的分化是由於許多引起屬病理過程的特點:不同的課程和結核分枝桿菌和結局,自然耐藥性存在一定的抗結核藥物。

應當認識到,結核分枝桿菌複合M.從分枝桿菌的主要nontubercular鑑定通過以下特徵進行的:在固體營養培養基,色素沉著,菌落形態,耐酸性和溫度最適生長的存在的生長速率。

不幸的是,沒有單一的實驗室方法來可靠地區分結核分枝桿菌,從其他抗酸桿菌複雜分枝桿菌,但在上面與下面的一些生化試驗所給出的結果所描述的特徵組合允許結核分枝桿菌複合物與M.可能的識別95%。

對結核分枝複雜的結核分枝桿菌的從慢生長的分枝桿菌用於該檢測的以下症狀的存在nontubercular基本生化試驗的分化(結核分枝桿菌,牛分枝桿菌,M. BovisBCG,非洲分枝,田鼠分枝桿菌,M. Canettii和其他):

  • 菸酸生產能力(菸酸測試):
  • 硝酸還原酶活性;
  • 耐熱性過氧化氫酶;
  • 在含有水楊酸鈉(1mg / ml)的培養基上生長。

作為附加測試,也可以使用含有500μg/ ml對硝基苯甲酸或5%氯化鈉的培養基生長。

許多細菌學實驗室僅在復合體層面鑑定這些微生物,這是由於實驗室的能力有限和專家的方法能力所致。

在大多數情況下,然而,在實踐中用於區分結核分枝桿菌和牛分枝桿菌是足夠以下測試:菸酸,硝酸的含存在下,存在登記和pirazinamidazy生長在培養基中的2μg/ ml的噻吩-2-羧酸酰肼。考慮到結核分枝桿菌複合群的分枝桿菌特徵在於以下一組特徵:

  • 增長緩慢(超過3週);
  • 在35-37範圍內的生長溫度ö ℃;
  • 沒有色素沉著(象牙色);
  • 顯著的耐酸性;
  • 積極的菸酸測試;
  • 陽性硝酸鹽還原酶測試;
  • 缺乏熱穩定過氧化氫酶(68 ° C)。
  • Levenstein-Jensen培養基上沒有生長,其中含有:
    • 1000μg/ ml水楊酸鈉,
    • 500μg/ ml的對硝基苯甲酸,
    • 5%氯化鈉:
  • 在1-5μg/ ml噻吩-2-羧酸存在下生長。

隨著與結核病或分枝桿菌病相關的艾滋病病例的記錄頻率的增加,分離的分枝桿菌的分化的相關性將顯著增加。目前,實際的區域實驗室準備好正確執行這一工作量並不是絕對肯定的。

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結核病的免疫學診斷

有許多普遍的現象,藥物和免疫學試驗最初是由結核病或對分枝桿菌的免疫應答模型發現的。這些包括BCG結核菌素,這樣的現象如皮膚DTH(結核菌素 - Pirquet和結核菌素反應)時,反應到皮下結核菌素致敏動物(科赫現象)。傳染病中的第一個抗體之一也在結核病中發現。當然,對抗結核免疫機制及其遺傳控制機制的理解越深入,使用免疫學方法和影響免疫力的藥物就可以更廣泛地解決病理生理學的實際問題。

目前最重要和最困難的實際問題是在大規模篩查人群的過程中發現結核病。然而,儘管有許多關於“成功”的報導(有限的資料),但沒有合適的免疫學方法(可在“任何武器”中重現)和適用於此目的的藥物。

免疫學方法,特別是血清學研究(測定抗原,抗體)和結核菌素激發試驗在臨床實踐中被廣泛使用。

在用於鑑別診斷的免疫學研究中,首先有血清學方法 - 測定身體不同環境中的抗原和抗體。

抗結核分枝桿菌抗體的特異性取決於免疫分析中使用的抗原。提出了大量的抗原,其中第一個是結核菌素PPD:

  • PAP和其他來自培養液的複合製劑;
  • 超聲波崩解;
  • Triton提取物和其他細胞壁的複合製劑;
  • 5-抗原(Daniel);
  • 60抗原(Coccito);
  • 脂阿拉伯甘露聚醣;
  • 繩索因子(海藻糖-6,6-二 - mycollate);
  • 酚類和其他醣脂;
  • 脂多醣;
  • 纖連蛋白結合抗原;
  • 蛋白質(通常是重組的); CDA等81.65,38,34,30,19,18,16,15.12

由於多年的俄羅斯和外國科學家的研究結果揭示的基本規律和肺結核的抗體血清學診斷的效果:更複雜的抗原,高靈敏度和測試的特異性較低。特異性在不同的國家取決於結核分枝桿菌感染和攜帶接種卡介苗等nontubercular分枝桿菌的人群。在兒童中,血清學診斷的信息含量比成人低。在原發性結核病(更常見的是兒童)中,IgM的定義更具信息性。與二次IgG。在HIV感染患者中,確定抗體時血清診斷的信息價值降低。抗體的效率確定取決於“臨床方面”的個數:處理活性(存在或不存在空腔“隔離”分枝桿菌存在衰減,浸潤程度的),處理的流行,其流動的持續時間。

酶免疫分析法(ELISA)的靈敏度約為70%。該研究的有效性不足是由於其特異性低。以前,考慮在高危人群中使用血清學篩查的可能性,特別是肺部結核病變後的人群。

為了提高ELISA的特異性,尋找更具體的抗原,包括通過基因工程獲得的抗原:ESAT-6等(見上文)繼續。嚴格特異性抗原(38kDa,ESAT)的使用增加了特異性。但會顯著降低分析的靈敏度。隨著IFA(實驗實驗室的測試系統。例如Pathozyme ELISA試劑盒)還提供了具有外側免疫層析過濾(Mycodot),以及其他類似的測試(在膜的點分析)與所述測試結果的視覺評估的試劑盒。在這些測試中,分析進行10-30分鐘; 他們不需要特殊設備,他們需要對結果進行視覺評估,這與一定的主觀性有關。這些方法具有與傳統ELISA大致相同的靈敏度和特異性特徵(分別為70%和90-93%)。

免疫分析方法的使用在結核病的鑑別診斷,特別是肺外形態的診斷中,作為附加的,在所使用的方法的綜合體中考慮到的具有確定的價值。最有效的ELISA方法是在腦脊液研究中診斷結核性腦膜炎。在這種情況下,分析的靈敏度為80-85%,特異性為97-98%。有關結核性葡萄膜炎診斷中淚液中結核分枝桿菌抗體檢測有效性的數據。

體外誘導γ干擾素合成

γ干擾素(IFN-γ)是通過激活巨噬細胞酶系統實現的特異性免疫防禦因子。致敏T淋巴細胞誘導IFN-γ合成導致其與分枝桿菌抗原的相互作用。

作為抗原用作結核菌素PPD。和特定的抗原,通過基因工程獲得,特別是抗原ESAT-6(早期分泌具有分子量6kDa的抗原)和CFP-10(培養濾液蛋白10 kDa的)。BCG疫苗和其他分枝桿菌細胞中不存在基因工程或重組抗原。當使用結核菌素時,誘導試驗IFN-γ的結果與結核菌素皮膚試驗的結果相當(直接相關)。使用基因工程抗原時,檢測結果更加具體,不依賴於以前的卡介苗接種。在測試未接觸過結核感染的接種疫苗的人時,測試的特異性為99%。該測試對結核病患者的敏感度在81%至89%之間。

基於從血液中分離的與IFN-γ濃度的連續測定的結核分枝桿菌在體外抗原或通過計數T淋巴細胞,其合成IFN-γ的數量的單元或全血單核細胞的短期培養測試和診斷工具已被開發。使用結合IFN-γ的單克隆抗體,通過ELISA確定在試管中合成的干擾素濃度。然後,通過校準標準IFN-γ,其濃度在試管或孔板中測定。

進行Elispot試驗時,合成IFN-γ的T-肌球蛋白的數量。計數在塗有抗IFN-γ抗體的平板的表面上。

開發診斷液對IFN-γ的體外通過感應,這是由該機構用於藥品和美國批准的產品,如權利要求一個測試是不可能的活動性結核病潛伏性的TB感染之間進行區分。因此,在感染率高的地區,檢測不是直接診斷。但是,在我國,它可以用來區分兒童結核感染和接種後過敏,並評估治療過程中特異性免疫水平。

目前,正在研究用於確定特異性結核抗原在體外誘導IFN-γ合成的國內測試系統。

免疫狀態和結核病過程,免疫糾正

在人類治療結核病的過程中,抗原血症和免疫系統狀態發生變化。

有關滲出物和組織變化的數據在很大程度上是相互矛盾的。唯一可以有充分理由注意到的是,在結核性肉芽腫中,通常檢測到大量活化的T淋巴細胞。

關於理解免疫機制在人類結核病治療中的作用需要兩個更多規定是有意義的:

  • 艾滋病患者多重耐藥發生率特別高;
  • 具有多重抗藥性(並且在沒有HIV感染的情況下),免疫性疾病(尤其是T細胞關聯)尤其顯著。

當結核廣泛應用於免疫調節的各種方法:它主要是主要在T細胞免疫作用藥物和單核吞噬細胞的系統(胸腺激素,異佛爾酮,likopid,polioksidony等人)中。以及整個(減毒的)分枝桿菌及其組分。

分子生物學診斷結核病

對於感染性疾病的診斷的分子生物學方法包括,主要是基於與細菌和病毒病原體的基因組材料操縱,以確定特定的遺傳材料的方法: - 具有核苷酸序列特異於特定的類型或病原體菌株來分析特定DNA片段的確定病原體對某些藥用物質的敏感性以及功能分析的基因中的DNA序列 病原體某些基因的活性。分子生物學技術在科學研究和在診斷實際應用和各種細菌和病毒感染的監測是廣泛在1985年開後,卡麗Myullisom聚合酶鏈反應(諾貝爾獎。1989獲得者)。

聚合酶鍊式反應方法的原理和可能性

PCR允許以百萬倍的時間在體外擴增(繁殖)核苷酸序列(病原體的DNA片段)數小時。單DNA鏈存在下的反應決定了測定的極高靈敏度。

DNA鏈中某些區域的核苷酸序列決定了微生物的遺傳特性,這解釋了PCR的高特異性。

這種技術引起的具有非常緩慢的生長的微生物的結核分枝桿菌的生物學特性的特性的檢測和調查的值:倍增結核分枝桿菌DNA的時候,培養是12-24小時。

PCR方法的原理在於擴增 - 數百萬次。在以下三個反應階段的循環復發期間將管中微體積的特定DNA序列的片段相乘,其中每一個反應階段中的每一個都以不同的溫度狀態通過:

  • 階段I-加熱時雙鏈DNA變性,鏈分歧;
  • II階段 - 引物(引發寡核苷酸)與嚴格特異性鏈的末端區段的互補結合(雜交),所述末端區段選擇用於DNA片段的增殖;
  • 第三階段 - 在熱穩定DNA聚合酶的幫助下完成DNA片段鏈。

為了擴增體外,必須有基質DNA分子。腺嘌呤(A),胸腺嘧啶(T),鳥嘌呤(D),胞嘧啶(C);四種類型的含有相應含氮鹼基的脫氧核苷三磷酸(核苷酸)人工合成的引發寡核苷酸(引物)由18-20個鹼基對組成; 具有68-72最適溫度,耐熱性DNA聚合酶上的 C,和鎂離子。

PCR的特異性取決於DNA片段的選擇。據此,合成側翼種子寡核苷酸。DNA鏈的雜交和完成的特異性歸因於以下成對含氮鹼基的互補原理:腺嘌呤 - 胸腺嘧啶,鳥嘌呤 - 胞嘧啶。

為了確定基因組結核分枝桿菌複合物最有效的靶標擴增在選擇IS6110的DNA片段大多數測試系統,該系統在結核分枝桿菌基因組中的大多數菌株具有重複的顯著數(10-20),它提供,具有特異性,測定的高靈敏度沿。同時描述了具有少量重複或不存在IS6110片段的結核分枝桿菌菌株。

從生物樣品中分離DNA分子

為了進行PCR,病原體的DNA分子應該以最小的體積從生物材料中分離,用最少量的非特異性DNA和酶-DNA聚合酶的各種抑製劑。

樣品的製備應在防止樣品被分離的DNA分子交叉污染的條件下進行。要做到這一點,需要用含氯溶液對桌子和家電的紫外線,地板和工作表面進行預處理。還強制使用乾淨的手套,一次性試管和自動移液器的提示。

在3-4千隔離從臨床標本結核分枝桿菌不含有大量的細胞,細胞碎片,或它們的鹽的DNA(腦脊液,支氣管洗),足以離心樣品。rpm時,添加到污泥的20-30微升2%的溶液TRITON X-100,並在90溫熱 ℃30分鐘。

為了製備痰樣品必須高效液化,其通常用於在每個樣品50-80毫克的量的氫氧化鈉和N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)的4%溶液 - 取決於樣品的粘度。NALC溶液必須是臨時製備的,或者NALC粉末可以直接添加到樣品中。液化後,應將樣品在帶有螺帽的50ml小瓶中以3.5-4,000rpm(3000g)離心15分鐘,即E. 在推薦用於化痰準備的相同條件下。

對於DNA的從沉澱法提取是最經常使用基於使用異硫氰酸胍裂解試劑的作為微多孔顆粒和氧化矽(“矽藻土”)吸附DNA分子的5-6摩爾溶液。非特異性的物質,包括酶抑製劑可能的,那麼在異硫氰酸胍和乙醇溶液的2.5摩爾溶液,之後將DNA分子在水中解吸洗滌,這些樣品用於進行PCR。為了簡化DNA提取技術,“矽藻土”常常被塗覆有氧化矽的磁性微粒代替。在這種情況下,使用專用的微型管磁力架代替離心沉澱顆粒。

在俄羅斯,開發了用於免疫磁性分離分枝桿菌的原始方法,然後提取病原體的DNA。對結核分枝桿菌免疫磁性分離使用的3-5微米ferroparticles大小,塗覆有氧化矽,到其通過化學鍵合的多克隆(兔)抗體的結核分枝桿菌附接。鹼性裂解後的痰樣品用酸性tris-HCl溶液中和,並用免疫磁性吸附劑溫育。然後,用具有可替換尖端的磁棒收集免疫小顆粒,轉移至微管並沉澱。加入20-30μl的2%Triton X-100溶液並在90 溫熱30分鐘。將上清液用作用於PCR分析的DNA模板。

一個棘手的問題是從活檢標本中分離結核分枝桿菌DNA。對於酶活組織檢查,酶蛋白酶K在56 的溫度下以200-500mg / l的終濃度過夜使用。此外,使用已知方法之一。活檢的PCR分析中過量的非特異性DNA經常引起反應的抑制,這需要重複提取DNA。

檢測結果的方法

反應完成後,通過各種方法鑑定病原體的擴增DNA片段。

凝膠電泳法是眾所周知的。得到的DNA片段由含有所需特異性DNA片段的陽性對照或根據片段的已知大小(核苷酸對的數量)使用標準分子標記確定。

在存在特定染料的情況下,溴化乙錠包含在雙鏈DNA中。合成的DNA片段在紫外線的作用下檢測為帶狀發光。

DNA片段的大小,通過從開始的距離電泳確定,必須對應於已知的分子量標記或陽性對照。

用生物素標記的DNA探針,通過酶促反應,隨後檢測,例如通過結合到鏈黴抗生物素鹼性磷酸酶 - 確定基於單鏈PCR產物與寡核苷酸與其互補的雜交PCR結果的其他方法。

基於這種類型的檢測,已經建立了PCR分析儀,其中PCR反應結果的檢測是在酶反應顯示之後讀取樣品中的光密度的結果自動進行的。

這些方法的缺點是DNA分子片段相當短的實驗室內污染的可能性。當分子進入新的樣品時,它們成為PCR的基質並導致假陽性結果。

在這方面,為防止假陽性結果,引入了嚴格的分離和隔離處所規則:從生物樣本中提取DNA; 從清潔區域檢測結果(電泳)的場所。這些場所是可能受到污染的區域。另一個獨立的區域是一個潔淨室,用於將用於PCR的反應混合物導入試管中的DNA樣品。最後,假設主設備--DNA放大器應該放置在一個單獨的,可能是辦公室的房間裡。

為了防止以上反應的產物的污染-一些Likon-Amp PCR系統測試代替dezoksinukleozidtimidina含有dezoksinukleoziduridin其中當在體外合成電路併入而不是在適當的位置,即 存在於天然DNA中的胸腺嘧啶的含氮鹼基被尿嘧啶取代。將尿嘧啶-DNA糖基化酶添加到反應混合物中以分析所分析的物質,僅破壞具有脫氧尿苷的污染物片段,但不破壞待分析的天然DNA。或者,隨後在94 加熱使該酶失活並且不干擾PCR中的擴增。

有一種基於rRNA等溫擴增的測試系統,首先進行DNA分子的逆轉錄和合成。而這又是RNA分子隨後合成的基質。當在反應管溶液中雜交時,使用吖啶染色的DNA探針檢測RNA擴增子。這種方法除了靈敏度高之外,還具有分析一根管子的優點,可防止污染。據作者稱,這種方法在呼吸道樣品中的靈敏度達到90%,特異性為99-100%。

新的檢測方法在實時PCR中實施。這些方法主要不同之處在於PCR和其結果的檢測在一個封閉管中同時進行。這不僅在技術上簡化了分析技術,而且還防止了以前PCR產物污染實驗室和測試樣品。

對於實時PCR,結果的檢測歸因於熒光DNA探針與在PCR期間擴增的特定DNA片段雜交產生的熒光。結構熒光DNA探針構造成使得熒光標記物僅在特定的雜交釋放酶反應的結果,或者從間隔猝滅分子熒光與PCR過程中被擴增的所需的DNA分子。與熒光的增加雜交探針分子的數量是正比於擴增產物的分子數的檢測水平。由於在PCR片段的DNA分子的每一個循環數量由一半相乘,在該熒光被確定,並增加反比於DNA分子的初始樣品中的數的循環數。如果反應是引入作為校準器相應的結核分枝桿菌的DNA片段分子的幾種不同的已知濃度,使用可以計算出該計算機程序和基因組DNA的在測試材料中的量。

每個標準樣本都是重複的。定量標準是確定的熒光開始和增長所需的PCR循環的最小次數。在橫坐標上 - 週期數量; 縱坐標是熒光值。DNA濃度與熒光出現所需的循環次數成反比。在右欄(21-32)中,標出了相應濃度的循環數。10倍濃度的DNA片段之間的差異10 2 -10 6 ml - 3.2-3.4個循環。對於兩名患者,IS6110片段的濃度約為10 3 / ml和10 4 / ml。考慮到在結核分枝桿菌基因組中分析的片段的重複數目(6-20),臨床樣品中的myco-細菌數量分別約為100和1000個細胞。

PCR在結核病診斷中的應用

PCR方法最常用於加速診斷結核病 - 在臨床標本中檢測結核分枝桿菌:痰。支氣管潮紅,胸膜滲出物,尿液,腦脊液,骨溶解點狀,女性生殖道吸出物和各種活檢標本。在荷蘭研究了340例確診為肺結核患者的約500例痰液和支氣管肺沖洗標本時,對PCR,培養和塗片顯微鏡的比較敏感性進行了研究。分析的靈敏度分別為92.6.88.9和52.4%。所有方法的特異性約為99%。

通過塗片顯微鏡檢查結核分枝桿菌的檢測,在Levenstein-Jensen培養基上播種,VASTES檢測系統和PCR分析的效果進行了比較。PCR顯示靈敏度為74.4%,顯微鏡為33.8%,播種在重培養基上為48.9%,VASTES為55.8%。在Levenstein-Jensen培養基上播種的平均檢測時間為24天。VASTES - 13天,PCR - 1天。

還討論了使用PCR作為監測結核病治療有效性的敏感和快速方法的可能性。

通過PCR結核分枝桿菌DNA與在較長的時間來確定有效的化療的檢測 - 平均1.7個月與在熒光顯微鏡下定義的塗片進行比較,並且通過2.5個月與細菌學檢查進行比較。

肺外形式肺結核的診斷

值作為敏感PCR方法是一種用於肺外形式特別大,因為它形成下對結核分枝桿菌的中無效診斷材料確定這些臨床和放射學方法的常規細菌的方法。

在尿樣的調查PCR結果在17 16患者活動性TB和陰性尿4例不活動腎結核和39例泌尿系統疾病nontubercular陽性。

在發現不明原因發熱患者的骨髓抽吸物研究中,PCR分析的有效性在疑似結核病例中得到證實。為了診斷結核性淋巴結炎,對兒童中的102名穿刺抽吸物和67名疑似結核性淋巴結炎兒童的活檢標本進行了研究。獲得陽性結果:71.6%的實時PCR。熒光顯微鏡 - 46.3%。文化研究 - 41.8%。在對“貓抓”病人進行50次淋巴結活檢的研究中,所有結果均為陰性。因此,證明了PCR分析的100%特異性。在同一項工作中,通過對淋巴結進行穿刺活檢,證明了檢測鳥分枝桿菌的可能性。

眾所周知,診斷女性生殖器區域不孕的結核病是診斷中最困難的問題之一。當由子宮內膜活檢PCR檢查,子宮內膜抽吸從25例患者道格拉斯空間14(56%)的液體樣品已審查腹腔鏡疑似結核,獲得陽性結果。使用塗片顯微鏡和培養,分別獲得1和2個結果。這些病例也是PCR陽性的。根據組織學研究,大多數PCR陽性結果與具有結核病特徵的病例相關; 根據腹腔鏡數據懷疑結核病的人數較少。在缺乏結核病腹腔鏡數據的情況下,只有一個PCR分析陽性結果。

當診斷肺外形式的結核病時,臨床醫生通常會在用PCR方法檢測血樣時檢測病原體的可能性。文獻資料表明,從血液樣本中檢測到結核分枝桿菌的DNA對於HIV感染的影響是深遠的。結核分枝桿菌的DNA僅在移植腎和免疫抑制患者的各種器官的普遍結核中檢測到。

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物種鑑定分枝桿菌

PCR法可以接收它們的初始生長後成為桿菌複合群的分枝桿菌和分枝桿菌nontubercular的一些物種的快速鑑定相當有效。在這種情況下,使用PCR可以節省7-10天,這對於隨後的文化鑑定結果是必要的。PCR測試在技術上非常簡單,因為它不需要復雜的臨床材料樣品製備以實現高靈敏度。在這項研究中80在這個測試系統陽性(MB華斯度。歐加農公司)PCR的一切積極的文化進行了嚴格具體的和1天舉行。識別用標記有吖啶和通過經由化學發光或硝酸纖維素條的化學發光的外觀與雜交後視覺評估檢測到的菌株的特異性DNA探針雜交的病原體培養物DNA的製備其他種類的分枝桿菌。在這樣一套幫助下,確定了數量有限的物種:結核分枝桿菌複合物。鳥分枝桿菌,鳥分枝桿菌複合體,堪薩斯分枝桿菌和戈登納分枝桿菌。

A.Telenti等人 還開發了一種相對簡單和便宜的物種鑑定分枝桿菌的臨床上重要的物種的通過PCR和隨後的處理方法與(具有酶特性切割在特定點處的DNA分子)兩種限制酶。擴增DNA片段。其編碼熱休克蛋白(65kDa),然後用PCR產生的439個核苷酸對的PCR片段分別用兩種酶Bste II和Nae III處理。然後用瓊脂糖凝膠電泳獲得的兩個產品,確定使用在長度一組標準的DNA片段(DNA分子標記物)為100至1000個鹼基對它們的大小(鹼基對數)進行分析。在每個特定類型的(結核分枝桿菌,鳥分枝桿菌,胞內分枝桿菌,堪薩斯分枝桿菌,M.fortuitum)的檢測不同尺寸的兩個或三個DNA片段的每個限制性酶。所獲得的不同DNA大小的組合允許區分這些物種。

生物DNA微陣列技術正在開發中。這將有助於在一項研究中識別100多種分枝桿菌。

通過對16S rRNA可變區進行PCR擴增,然後進行擴增子測序,與相應的一級結構進行比較,可以進行物種鑑定,從而可以鑑定40多種分枝桿菌。

使用PCR也可以結核分枝桿菌複合物的品種鑑定內執行,包括牛分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG的分化。為此,分析RD1的基因組區域中是否存在一些基因。RD9和RD10。RD1在牛分枝桿菌卡介苗中不存在,但存在於包括牛分枝桿菌在內的有毒物種中。

用PCR方法測定結核分枝桿菌的藥物敏感性

用於藥物敏感性或結核分枝桿菌的抗性的分子遺傳學方法的目標降低識別已知基因的特定核苷酸序列的突變。基本方法或者基於PCR的DNA探針中擴增生物素標記的DNA片段的擴增或雜交後這些序列的直接prochityvanii(測序)。兩種替代方案涉及識別在使用DNA探針導致不存在的或不完整的雜交使用酶偶聯物(鏈親和素 - 鹼性磷酸酶)硝酸纖維素膜的序列中的核苷酸取代 - 方法LIPA-RIF-TB。

用於測量局部固定在顯微切片的DNA探針,以負責抗性或藥物敏感性的PCR擴增的基因區域的已知突變,稱為mikrobiochipov方法互補的熒光方法。開展這項研究的主要算法如下。從分枝桿菌的臨床樣品或培養物中分離DNA之後有必要進行負責藥物敏感性利福平或編碼結核分枝桿菌蛋白負責的異煙肼敏感性katG基因和基因的inhA rpoB基因的相關片段的PCR擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳PCR結果進行評價,其中,確認收到的所需長度的適當的DNA片段。然後,進行第二輪PCR以將熒光標記引入DNA中。PCR的結果再次通過凝膠電泳確認。此後,進行雜交(過夜培養),其次是在生物芯片上,這是一個大數目的固定在一個小的玻璃板短的DNA鏈(探針),它們是互補的可能突變的點至核苷酸藥物敏感型結核桿菌的序列洗滌所得材料。以及負責耐藥性的突變序列。在板的DNA探針的位置 - 嚴格限定,並且雜交時觀察到的熒光水平使用特殊的讀取裝置,以確定被安裝的結果。在這方面,分析結果是通過特殊的計算機程序確定的。

近年來,基於實時PCR技術開發了用於確定結核分枝桿菌藥物敏感性的替代方法,這使得可以在閉管試驗中進行這些研究。

在圖1中,圖13-13顯示了通過實時PCR測定對利福平耐藥性的結核分枝桿菌臨床培養物的分析結果:218-對照樣品(對利福平敏感); 93 - Ser-Trp TCG-TGG突變的陽性對照; 4482 - Ser-Leu TCG-TTG突變的陽性對照; 162-322 - 實驗樣本。4通道擴增動力學曲線計算結果:通道1:393 - Ser-Trp TCG-TGG突變陽性對照; 通道2:4482 - Ser-Leu TCG-TTG突變的陽性對照; 162,163,172,295 - 實驗樣品; 通道4:參與實驗的所有樣品的擴增動力學曲線。擴增反應的陽性對照。結論:根據分析結果,揭示了以下決定利福平耐藥性的突變:樣品162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG。使用相同的原理來確定對基因katG和inhA的異煙肼耐藥性,這決定了最常見的突變。

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結核分枝桿菌的菌株鑑定

的結核分枝桿菌菌株的鑑定研究最徹底的方法是這樣一種技術被稱為限制性片段長度多態性(RFLP RFLP。或在英文版本),並且是基於結核分枝桿菌DNA酶的Pvu II的fragmentirovanin(限制)和片段獲得的後續雜交DNA上的某些特定序列其重複元素IS6110。種內變異通過重複IS6110及其對DNA位置的不同數量來實現。以及各種攻擊限制性內切酶的某些點(限制性位點)和元件IS6110之間的距離。這項技術非常複雜和耗時。與來自結核分枝桿菌的培養物中提取DNA處理後,凝膠電泳用限制性內切酶進行的,然後轉移到硝酸纖維素膜的不同長度的DNA片段,雜交用IS6110元件的片段進行,並且通過酶促反應來檢測。所得圖案特定的DNA條帶表徵結核分枝桿菌的特定菌株。在計算機分析的幫助下,揭示了菌株的身份或相關性。儘管RFLP方法是最具歧視性的事實,即 識別在所分析的菌株差異最大數目,它是無效的少數在一些菌株觀察到的(低於5)IS6110重複序列。在圖1中,圖13-14顯示了菌株的RFLP分型結果。

替代方案可以是spoligotyping方法 - 分析間隔區DNA序列的多態性 - DR區直接重複之間的中間。當進行菌株的spoligotyping時,使用DR區域的引物進行PCR,之後形成與DNA的可變中間區域雜交的不同長度的片段。介紹DR區域的間隔序列的分析。據研究人員介紹,該方法簡單,生產性好,適用於初步篩選菌株和初步流行病學分析,以及直接研究臨床資料。

顯然,更有效和技術上可行的方法是VNTR(英文單詞的縮寫)或確定結核分枝桿菌DNA中精確串聯重複的可變數目的方法。該方法僅基於PCR的使用,不需要額外的操作。由於不同菌株和不同位點的串聯重複數量不同,因此在PCR產物的所得電泳圖上確定並分析不同大小的片段。據研究人員稱,使用VNTR可以比RFLP方法更大程度地區分菌株。

近年來,W-Beijing家族(有時稱為北京株)的結核分枝桿菌菌株的分佈受到了很大關注,這些菌株在很大程度上都是耐藥的。

對分子生物學研究質量的基本要求

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PCR的基本管理文件

令俄羅斯衛生部:№45從2000年7月2日G ^ ..從2003年3月21日的數量g 109 ..從2000年2月21日,準則64號:1.3.1888-04“感染病原生物,使用PCR材料研究工作的組織致病性III-IV族製劑“; 1.3.1794-03“組織研究PCR物質,感染I-II致病性群體微生物的工作”。2003。2001附錄11的用於在識別,診斷和治療肺結核的微生物檢驗方法的統一指令3.5.5.1034-01“使用PCR,當該材料的去污,感染菌I-IV組的致病性”。

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工作人員

分子生物學研究的執行可能持有臨床實驗室診斷,醫生細菌學家,病毒學家,醫生,生物學家,臨床診斷實驗室,以及專家與中等醫學教育的醫生,通過專業化和先進的訓練以規定的方式。

實驗室場所的佈置

以下實驗室房間是必需的:

  • 根據方法說明13.1888-04,樣品處理區域是一個適用於III-IV致病性組感染因子的實驗室。
  • 用於製備反應混合物的區域PCR - 實驗室室,用於防止內部實驗室污染 - “清潔”區域。
  • •如果使用電泳或雜交分析PCR產物。在其中相乘的DNA片段被從管和擴增提取的實驗室房間,分別可以進入的環境中,根據用於PCR的實驗室的要求(1.3.1794-03準則,制導1.3.1888-04)必須充分與前段所述的處所隔離。它應該從運動區域排除到區帶電泳的樣品處理和任何人員,設備,任何材料和對象的“乾淨”的區域,以及空氣通過通風系統的轉移,或為草稿的結果。熒光檢測PCR產物不需要該區域。
  • 記錄和處理結果的空間配有計算機和必要的辦公設備。這個房間可能包含能夠在不打開管子的情況下檢測PCR產物的設備。 - 用於實時PCR的熒光PCR檢測器和熱循環儀。

痰初級治療的衛生和流行病學要求與結核分枝桿菌工作的標準微生物學要求相似。

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完成PCR診斷的實驗室設備

實驗室包括以下房間的設備。

  • 樣品製備室包含以下設備:II級保護層“SP-1.2”:帶“Eppendorf”型試管加熱蓋的固態恆溫器; 以13,000rpm微量離心; 離心機(Vortex); 冰箱的溫度範圍從-20 C10至大約 ℃; 可變容量的“Rroline”系列移液器; 帶有OM-1收集瓶的泵; 移液器三腳架; 三腳架工作站200x0.5毫升; 三腳架工作站50x1.5毫升; 代表儲存試管80x1.5毫升;
  • 反應混合物製備室:保護室PCR-box(“Laminar-C.110cm); 離心機 - 漩渦; 可變容積的Proline系列移液器; 移液器三腳架; 三腳架工作站200x0.2毫升; 代表儲存試管80x1.5毫升; 冰箱的溫度範圍從-20 C到+ 10 C。;
  • 電泳室:水平電泳相機; 電源; 透;
  • DNA放大器或核酸分析儀(實時PCR),帶有計算機和軟件; 可以放在任何空餘房間裡。如果使用實時PCR技術。不需要電泳室。

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外部質量控制

為了獲得客觀可靠的結果,實驗室應該參與實驗室研究質量的外部評估系統。

質量控制體系的參與者獲得; 冷凍乾燥的細菌細胞懸浮液12的小瓶,其中兩個包含大腸桿菌E.椰殼,3小瓶在10結核分枝桿菌(無毒菌株)2 / ml的; 3個含有濃度為10 4 / ml 的相似菌株細胞的安瓿; 2個安瓿瓶,非結核分枝桿菌M.acidium-intracellulare和堪薩斯分枝桿菌,濃度為10 5 / ml。

分佈式外部質量評估測試在兩個獨立的實驗室進行了預先測試,這些實驗室在該領域擁有豐富的經驗

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