軟骨是一種高度專業化的組織,只含有一種類型的細胞(軟骨細胞),其特徵是沒有血液和淋巴管。軟骨的營養主要通過從滑液吸收進行。軟骨細胞的代謝受軟骨細胞和周圍組織局部產生的許多可溶性因子調節。軟骨細胞的功能還取決於細胞外介質的組成(氧張力,離子濃度,pH等),VCM組成,細胞和基質相互作用,物理信號。實驗建模的主要任務是在不改變成熟細胞表型的情況下在細胞外環境中產生培養物。第二項任務是創建培養物,用於研究軟骨細胞對化學和/或物理信號的過早,延遲,短期或長期反應。研究體外還提供了一個機會,研究在骨關節炎軟骨細胞的行為。第三項任務是開發聯合治療系統,以研究關節中各種組織的相互作用。第四項任務是為隨後的移植製備軟骨植入物。最後,第五項任務是研究能夠刺激修復和/或抑制其軟骨再吸收的生長因子,細胞因子或治療劑。
在過去的幾十年裡,創建了多種關節軟骨細胞培養模型,包括單層培養,懸浮培養,軟骨細胞培養,外植體,共培養,永生細胞培養。每種培養都有其優點和缺點,並且適合研究軟骨細胞代謝的一個特定方面。因此,軟骨外植體是研究基質元件更新的優秀模型,其需要真正的細胞表面受體以及正常的細胞基質和基質 - 細胞相互作用。同時,研究基質中的沉積物或調節軟骨細胞代謝的機制建議在分離的細胞培養物上進行。單層低密度培養是研究細胞分化過程所必需的。懸浮於天然或合成基質中的培養物是分析軟骨細胞對機械應激的適應性反應的模型。
軟骨細胞培養
當選擇軟骨組織進行體外研究時,需要考慮幾個重要的問題。軟骨細胞的基質組成和代謝活性在不同的關節中有所不同,後者也取決於組織中軟骨細胞的深度。這些數據是在幾個實驗中獲得的,其中研究了來自不同深度軟骨區的軟骨細胞的分離亞群。在位於關節軟骨表面和深層的培養軟骨細胞之間發現了許多形態學和生物化學差異。表面細胞合成稀少的,耗盡的蛋白多醣纖維狀基質,而較深的細胞產生富含原纖維和蛋白多醣的基質。而且,表面細胞產生的相對較小的非聚集的蛋白多醣和透明質酸以及相對較少的聚集蛋白聚醣和硫酸角質素比深層定位的軟骨細胞少。從不同深度的軟骨區分離的軟骨細胞代謝的另一個重要特徵是對外源刺激的反應。根據M. Aydelotte和合著者的說法,來自軟骨表面區域的公牛軟骨細胞對IL-1比對深層細胞更敏感。
細胞的行為還取決於組織的位置。軟骨細胞的軟骨和耳的邊緣,從該不同的反應生長因子,如成纖維細胞生長因子(FGF),和TGF-β相同的動物服用。FGF增加胸腺嘧啶核苷摻入,脯氨酸和亮氨酸肋骨軟骨細胞的文化,但不是耳朵。TGF-β增加胸苷成軟骨細胞肋骨及耳的結合,卻不得不為軟骨細胞和脯氨酸耳朵上的胸腺嘧啶核苷摻入沒有影響。從負荷最大的區域獲得的軟骨細胞與軟骨負荷低的部位不同。例如,從綿羊關節脛骨表面的中央區域中的膝關節軟骨的成熟軟骨細胞沒有被半月板,其承載的最大負荷覆蓋體內,更小的合成聚集蛋白聚醣,核心蛋白聚醣,但比由彎月面所覆蓋的區域的細胞大。作者還強調了在檢查關節的合成功能時使用來自相同關節區的軟骨的重要性。
軟骨細胞的代謝及其對調節因子的反應也顯著取決於供體的年齡,骨骼的發育和細胞攝取的關節狀態。在人類軟骨細胞中,觀察到增殖反應的年齡隨著年齡的增加而顯著下降。在40-50歲和60多歲的捐助者中觀察到最大的下降。而且,衰老期間對生長因子(例如FGF和TGF-β)的增殖反應的嚴重性降低。除了軟骨細胞增殖的數量變化之外,還有質的變化。年輕供體細胞(10-20歲)對血小板衍生生長因子(PDGF)的反應優於TGF-β,而在成人供體細胞中觀察到相反的情況。為了解釋軟骨細胞合成功能的年齡依賴性變化及其對生長因子作用的反應,使用了幾種機制。其中,表面細胞受體的數量和親和力下降,生長因子和細胞因子的合成和生物活性的改變,後受體信號的修飾。
關節的病理狀況也改變了軟骨細胞的形態和代謝活性。因此,J.Kouri和合著者(1996)在骨關節炎軟骨中發現了三個軟骨細胞亞群。來自軟骨表面和上中部的軟骨形成簇並合成更多蛋白聚醣和膠原蛋白。TGF-β,和胰島素樣生長因子(IGF)可以通過軟骨細胞刺激蛋白聚醣的合成和部分地中和IL-1的效果和TNF-α。軟骨外植體用骨關節炎,和從骨關節炎患者的軟骨中分離的軟骨細胞,是對TGF-β比健康軟骨的軟骨細胞的刺激更敏感。這些差異很可能與關節軟骨上層軟骨細胞的表型變化有關。
通過用ECM的蛋白水解酶連續處理實現單個軟骨細胞的分離。從ECM中釋放後,分離的細胞非常適合研究de novo基質組分的合成。一些作者僅使用梭菌膠原酶,另一些使用胰蛋白酶,鏈黴蛋白酶,DNA酶和/或透明質酸酶預孵育軟骨。分離細胞的數量取決於使用的酶。因此,當處理1克膠原酶的組織中的一個可以得到1,4T0 6 4,3-10 -鏈黴蛋白酶使用,透明質酸酶和膠原酶時,而軟骨細胞,6。當用膠原酶處理時,聚集蛋白聚醣,蛋白質,IL-6,IL-8保留在細胞培養物中的情況遠遠多於用各種酶進行連續處理的情況。這兩種細胞培養物之間的這些差異有幾種解釋:
- 損壞或通過酶的作用壓下細胞受體,TGF-β抑制了(1天)在新分離的軟骨細胞的蛋白聚醣的DNA合成,而DNA和由TGF-β刺激的軟骨細胞單層培養(7天)的蛋白聚醣的合成。然而,為了重新展現這些膜組件,在實驗開始之前需要足夠的時間。
- 外源蛋白酶可以打破整合素介導的細胞和基質的相互作用。整合素家族促進軟骨細胞附著於VKM分子(Shakibaei M.等人,1997)。這種破裂可影響基質基因的表達。
- 基質成分的殘留物可以調節軟骨細胞的合成功能。整合素能夠識別ECM的降解產物,從而在暴露於蛋白水解酶之後在組織修復中起重要作用。T.Larsson和合著者(1989)報導,向細胞培養物中添加完整或片段化的親葡聚醣可刺激蛋白質和蛋白多醣的合成。然而,高含量的透明質酸引起由軟骨細胞雞胚軟骨細胞包含硫酸鹽蛋白聚醣合成的顯著減少成熟豬和大鼠軟骨肉瘤細胞。此外,透明質酸 - 即使是在IL-1b中,TNF-α,FGF的存在從細胞蛋白聚醣釋放的抑製劑,指示第一反作用的生長因子和細胞因子的生物活性。透明質酸作用的確切機制尚不清楚; 已知軟骨細胞含有與胞質溶膠的肌動蛋白絲相關的透明質酸受體。透明質酸與其受體的結合刺激蛋白質的磷酸化。因此,這些數據證明了通過激活膜受體細胞,通過基質蛋白的片段化或天然分子調節軟骨細胞的代謝功能。
- 由軟骨細胞合成基質蛋白的酶的快速刺激可以是軟骨細胞形狀和/或細胞骨架重組的改變的結果。
- 一些細胞因子(例如IL-8)和生長因子(例如IGF-1,TGF-P)固定在ECM中。最著名的例子是TGF-β與decore的結合,導致前者在中國倉鼠的卵巢細胞中誘導細胞生長的能力下降。隨著年齡的增長,軟骨修飾的含量增加的數據表明衰老時TGF-β的生物利用度下降。生長因子和細胞因子可以在培養過程中從基質殘餘物中釋放出來,然後調節軟骨細胞的功能。
軟骨細胞的單層培養
軟骨細胞的分化表型主要特徵在於II型膠原和組織特異性蛋白聚醣的合成以及低水平的有絲分裂活性。有證據表明,隨著單層細胞的長時間培養,並且在多次重複傳代細胞後,軟骨細胞失去其球形輪廓,獲得伸長的成纖維細胞樣形狀。與這樣的成纖維細胞化生合成功能也修飾的細胞,在膠原蛋白II的合成,其特徵在於逐漸減小,IX和XI的類型和改進的膠原蛋白I,III和Utipov的合成。小的非聚集蛋白聚醣由功能性聚集蛋白聚醣合成。Synthetzatepsin B和L在分化細胞中極低,但在分化喪失的過程中增加。膠原酶-1在分化的軟骨細胞中表達,隨著培養時間延長,其表達降低,而金屬蛋白酶組織抑製劑(TIMP)的產生增加。
當分化的軟骨細胞從單層培養物轉移到懸浮培養物時,分化的軟骨細胞重新表達分化表型的膠原蛋白。分化的過程可能與細胞的形狀有關。這種性質經常用於研究有自體軟骨細胞的缺陷移植的研究人員。從活組織檢查材料中獲得的少量細胞可以在單層培養中繁殖,然後在移植前再次置於三維基質中。可以用TGF-p,一種骨磷酸羥基磷灰石複合物和抗壞血酸刺激去分化的軟骨細胞轉移到瓊脂糖培養物中來重新表達特定的表型。
響應生長因子和細胞因子的作用,軟骨細胞在分化過程中被修飾。對未分化和分化的軟骨細胞的細胞因子和生長因子的細胞應答是不同的。IL-1刺激成纖維細胞的增殖,而未分化的軟骨細胞的生長被IL-1抑制。IGF-1刺激DNA的合成,在細長而不是扁平化的軟骨細胞中。在分化的軟骨細胞中,IL-1β和TNF-α對前膠原酶產物的刺激作用比未分化的更顯著。
培養軟骨細胞
在液體培養基或天然或合成三維基質中懸浮軟骨細胞的培養穩定了軟骨細胞的表型。細胞保留其球形,合成組織特異性蛋白。通常推薦加權的軟骨細胞培養物用於研究新的胞外基質的形成。合成或天然吸收性聚合物中的軟骨細胞培養物用於將細胞植入軟骨缺陷中以刺激關節軟骨組織的再生。植入式細胞的合成或自然環境必須滿足許多要求:
- 植入物應具有用於粘附和細胞生長的多孔結構,
- 在體內植入過程中,聚合物本身和其降解產物都不應引起炎症或毒性反應,
- 移植載體應該能夠結合到相鄰的軟骨或軟骨下骨,
- 天然或合成基質必須能夠吸收,其降解必須通過組織再生來平衡,
- 為了促進軟骨修復,基質的化學結構和基質結構應有助於維持由軟骨細胞編碼的細胞表型並合成組織特異性蛋白質,
- 在體內植入期間,有必要研究合成或天然基質的機械性能。
液相中懸浮軟骨細胞
細胞附著到塑料容器中,其中軟骨細胞的培養可以防止塗有溶液的甲基纖維素,瓊脂糖,水凝膠(聚-2-羥乙基甲基丙烯酸酯)或膠原蛋白 - 瓊脂糖的混合物它們的壁。在這些條件下,軟骨細胞形成簇並主要合成聚集蛋白聚醣和組織特異性膠原(II,IX,XI類型)。通常找到兩種類型的單元格。位於中心的細胞保持球形,由良好發展的ECM包圍,這通過組織化學和超微結構研究證實。在外圍軟骨細胞具有盤狀輪廓,被罕見的ECM包圍; 對這種細胞的功能特性知之甚少。
在懸浮支持的微載體上培養軟骨細胞是可能的; 使用葡聚醣珠(cytodex),膠原包被的葡聚醣珠(cytodex III),I型膠原的非空隙微球體(膠原蛋白)作為微載體。在這些培養條件下,軟骨細胞附著在微載體表面,保持其球形,並產生基質樣物質。此外,使用膠原促進軟骨細胞的增殖和正常表型的再表達。因此,在膠原微球上培養軟骨細胞可用於在移植前恢復細胞表型。
培養懸浮在液體介質中的軟骨細胞的另一種方法是在其種植密珠的形式,其由細胞(0.5-1×10的b通過離心獲得)。這種軟骨細胞能夠產生含有大量蛋白聚醣,II型膠原的基質,但不是I型膠原,其通過組織學,免疫組織化學和定量方法確認。
在天然ECM中懸浮軟骨細胞
軟骨細胞可在懸浮液中培養在三維矩陣(軟瓊脂,瓊脂糖,調用基因凝膠或海綿,透明質酸,纖維蛋白膠,藻酸鹽珠)。
培養的瓊脂糖軟骨細胞保持其正常表型並合成II型膠原和組織特異性聚集體 - 新聚集體。當在瓊脂糖中培養時,細胞合成的蛋白聚醣在培養基中釋放50天。為了比較 - 在單層培養中,細胞相在培養的前5-6天已經充滿糖胺聚醣; 當在糖胺聚醣的合成和釋放增強後在培養基中培養時,糖胺聚醣的時間依賴性降低發生在前8-10天。然而,軟骨細胞在瓊脂糖培養過程中的行為與體內條件不同。在瓊脂糖中,大量合成的Aggregan聚集體含有比體內更小和更小的分子。TGF-β刺激外植體中蛋白多醣的合成,但減少了瓊脂糖中聚集蛋白聚醣的合成。
藻酸鹽是一種來自褐海藻的線性多醣。在二價陽離子如Ca 2+離子的存在下,該聚合物變成凝膠。每個軟骨細胞夾在藻酸鹽,通過帶負電荷的多醣的基質包圍,其中所述孔與透明軟骨的可比性。其上形成的軟骨細胞在藻酸鹽珠,由兩個段的矩陣-對應於關節軟骨和在天然組織多個遠程矩陣領土間等效的細胞外週和領土基質細胞相關矩陣的薄層。在培養的第30天,相對和絕對量由細胞佔據,並且每個兩個部門在藻酸鹽珠的是幾乎完全等同於那些天然軟骨的。近30天軟骨細胞保持其球形形狀和聚集蛋白聚醣的產生,流體動力性能,這是類似於在關節軟骨和膠原分子II,IX和XI型的基質聚集蛋白聚醣分子。同時,像其他文化,懸浮液,扁平細胞的表面上的藻酸鹽珠存在產生類型的少量I型膠原分子,直接釋放到環境中,在VCR不併入。在藻酸鹽珠中,觀察到軟骨細胞的中等增殖。經過8個月的藻酸鹽凝膠成熟軟骨細胞培養的不失去代謝活動,並繼續合成組織特異性Ⅱ型膠原蛋白聚醣和。
N.Tanaka和合作者(1984)研究了藻酸鹽中各種天然分子的擴散性質,發現大於70kD的分子不會通過藻酸鹽擴散。因此,藻酸鹽中細胞的培養適合研究基質生物合成的調節和ECM的組織。在藻酸鹽中培養的細胞的可用性允許我們研究肽調節因子和藥物對轉錄,轉錄後和翻譯水平的影響。
軟骨細胞也在膠原纖維I和II型的基質中培養。S. Nehrer等人(1997)相比在狗的軟骨細胞的蛋白聚醣的操作隔開含有不同類型的膠原膠原聚合物基質。他們發現在含有I型和II型膠原的膠原基質中培養的軟骨細胞的生物合成功能的形態學的重要差異。II型膠原基質中的細胞捲曲成球形,而在I型膠原中,它們具有成纖維細胞樣形態。而且,在II型膠原基質中,軟骨細胞產生更多的糖胺聚醣。J. Van Susante等人(1995)比較了在海藻酸鹽和膠原(I型)凝膠中培養的軟骨細胞的性質。作者發現在膠原凝膠細胞的數量顯著增加,但種植的第6天,細胞失去了其特有的表型,變成了成纖維細胞樣細胞。在藻酸鹽凝膠中,觀察到細胞數目減少,但軟骨細胞保持其正常表型。每個細胞的膠原凝膠蛋白聚醣的量分別比在藻酸鹽顯著較高,但在凝膠基質中的元素合成從培養的第6天開始觀察到了降低,而在藻酸鹽合成持續增長。
堅實的三維纖維蛋白基質是一種天然物質,它支持體內分化的表型的軟骨細胞。3D纖維蛋白基質也可以用作軟骨細胞移植的載體。纖維蛋白的優點是不存在細胞毒性,填充空間的能力和粘附能力。通過組織學和生化研究Autoren-diografii,電子顯微鏡透露,在纖維蛋白凝膠中的軟骨細胞保持它們的形態,繁殖和甚至2週的培養後,產生基質。然而,G.Homminga和合著者(1993)報導,在培養3天后,纖維蛋白的分解開始,軟骨細胞的去分化進行。
在人工(合成)ECM中懸浮軟骨細胞
用於重建或整形外科手術的軟骨植入物可以通過在合成的生物相容性基質中體外培養分離的軟骨細胞來獲得。
培養的聚乙醇酸軟骨細胞在8週內增殖並維持正常的形態和表型。軟骨細胞 - 聚乙醇酸複合物由細胞,糖胺聚醣,膠原蛋白組成,並且具有外膠原蛋白膠囊。然而,在這種植入物中存在兩種類型的膠原分子-I和II。去分化軟骨細胞一系列通道的植入物具有糖胺聚醣的更大量的蛋白和膠原蛋白比在未分化的原代軟骨細胞的植入物。
L. Freed和共同作者(1 993b)比較了纖維狀聚羥基乙酸(HPHC)和聚乳酸(PPLC)中人和軟骨細胞培養物的行為。在HSVG或PPLC中公牛軟骨細胞培養6-8週後,作者觀察到細胞增殖和軟骨基質再生。在HSBC中,軟骨細胞是球形的,位於由軟骨基質包圍的空隙中。體外培養8週後,再生組織含有高達50%的干物質(4%的細胞質量,15%的糖胺聚醣和31%的膠原蛋白)。在PPLK細胞中呈紡錘形,少量糖胺聚醣和膠原蛋白。在HSBC中,細胞生長比PTCA強2倍。在體內條件下,在HPVC和PPLC中生長1至6個月的軟骨細胞產生組織學上類似於軟骨的組織。植入物含有糖胺聚醣,I型和II型膠原蛋白。
胎牛軟骨細胞在多孔高密度疏水性和親水性聚乙烯中培養。在兩種底物中孵育7天后,細胞保持球形,主要含有II型膠原。培養21天后,結果表明親水基質比疏水基質含有更多的II型膠原。
也可以通過在Millicell-CM過濾器上單層培養獲得軟骨組織。用膠原蛋白預塗覆過濾器對於附著軟骨是必需的。培養的組織學檢查證明軟骨細胞在含有蛋白聚醣和II型膠原的ECM中的積聚。未檢測到這種培養中的I型膠原蛋白。所得軟骨組織中的軟骨細胞具有球形形狀,但在組織表面上它們有點扁平。新形成的組織的厚度隨時間增加並且取決於單層細胞的初始密度。在最佳培養條件下,軟骨組織的厚度達到110μm,其表面和深層中的細胞和膠原的組織與關節軟骨的組織相似。VKM含有大約3倍的膠原蛋白和蛋白多醣。培養2週後,注意到基質-a的積累,這使得從過濾器中提取組織並將其用於移植成為可能。
Sims等人(1996)研究了聚乙烯氧化物凝膠包封的聚合物基質中的軟骨細胞的培養,其允許通過注射運輸大量的細胞。注射到無胸腺小鼠的皮下組織後6週,形成新的軟骨,其形態特徵為與透明軟骨類似的白色乳光。來自組織學和生物化學研究的數據表明存在積極增殖的軟骨細胞,其產生ECM。
植
使用軟骨組織的檢查來研究其中的分解代謝過程,動態平衡,再吸收和修復。軟骨組織外植體中的軟骨細胞支持ECM的正常表型和組成,類似於體內關節軟骨中的那些。在血清存在下培養5天后,獲得恆定水平的合成和天然降解。吸收能加速組織培養,並與使用許多試劑,添加血清的主培養例如,IL-1B,TNF-α,bakterialnyhlipopolisaharidov,視黃酸或活性氧自由基的衍生物。為了研究軟骨的修復,其損傷由可溶性炎症介質(H 2 O 2,IL-1,TNF-α)或基質的物理破裂誘導。
器官培養的方法是研究離體外部因素對軟骨細胞和周圍基質的體外作用的模型。在體內,軟骨細胞很少位於ECM中,並且不會彼此接觸。外植體關節軟骨的培養保留了這種結構組織,以及軟骨細胞與其周圍細胞外環境之間的特定相互作用。該模型還用於研究機械應激,藥理學因子,生長因子,細胞因子,激素對軟骨代謝的影響。
軟骨組織移出的另一個優點是沒有蛋白水解酶引起的軟骨細胞損傷或機械因素,當分離細胞時這是不可避免的。受體和其他膜蛋白和糖蛋白受到保護以免受損害因素。
軟骨的文化
Hondron - 由軟骨細胞細胞外基質和其緊湊的燈絲膠囊和結構,功能和代謝關節軟骨單元負責基質的動態平衡。從軟骨機械地提取軟骨並通過幾次連續的低速均化來收集。單hondron,雙hondrony,多個(三個或更多個)線性排列hondrony(列hondronov)hondronov擁塞:從不同深度hondrony軟骨可分為四類的區域隔離。
單hondrony通常在完整的軟骨,雙中間層發現 - 在中間和深層的邊界直線排列的多個hondrony典型的完整的軟骨深層。最後,由一系列隨機組成的單一和配對的軟骨組成,它們在均化後保持聚集狀態。軟骨的堆積物是軟骨的大片段,通常含有幾個軟骨和放射狀定位的膠原原纖維,即基質深層的典型組織特徵。Chondrons被固定在透明的瓊脂糖中,這可以研究它們的結構,分子組成和代謝活性。該軟骨 - 瓊脂糖系統被認為是一種軟骨微型模型,它不同於傳統的軟骨細胞 - 瓊脂糖系統,因為它保持了自然的微環境,不需要進行其合成和裝配。膝關節軟骨的培養是研究正常和病理狀態下關節軟骨中細胞和基質相互作用的模型。
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不朽軟骨細胞的培養
為了產生永久性細胞系,使用能夠使細胞“不朽”的重組DNA或含有致癌基因的病毒。不朽的軟骨細胞具有無限增殖的能力,維持穩定的表型。F.鼻疽菌素-日蘭等人(1995)表明,致癌基因是小鼠軟骨細胞,其因而繼續穩定地表達膠原II,IX和XI型,以及關節和聚集蛋白聚醣結合蛋白的SV40T誘導的增殖。然而,這種細胞系在單層培養或瓊脂糖凝膠中培養時具有合成I型膠原的能力。
W.霍頓和共同作者(1988)描述了一系列具有低水平II型膠原mRNA表達的永生細胞。這些細胞通過用含有I-myc-和γ-ra-癌基因的小鼠逆轉錄病毒轉化來獲得。這種類型的細胞是一種獨特的模型,用於研究缺少II型膠原的關節基質的相互作用,以及II型膠原合成的調節。
具有突變或缺失基因的軟骨細胞的培養是研究其生理功能的便利模型。該模型尤其適合於研究具體分子的軟骨基質組織中的作用或學習對軟骨代謝的各種調控因子的影響。軟骨細胞比正常更寬遠程基因合成的膠原IX型膠原原纖維,這表明膠原IX型調節原纖維的直徑。正如我在第1章中,新發現的II基因突變COLAI編碼類型膠原與原發性全身骨關節炎家庭指出。為了研究突變體II型膠原的作用在關節矩陣R. Dharmrvaram等人(1997)進行的轉染(“污染”外來核酸)缺陷COL 2在人胎兒軟骨細胞AI(在519位的精氨酸被半胱氨酸替換)在體外進行。
共同體系。在關節中,軟骨與滑膜,滑液,韌帶,軟骨下骨中包含的其他類型的細胞相互作用。軟骨細胞的代謝可受到由這些細胞合成的各種可溶性因子的影響。因此,關節炎關節軟骨被滑膜細胞產生的蛋白水解酶和自由基破壞。因此,已經開發了模型來研究軟骨和周圍組織之間的複雜相互作用,這被稱為共培養。
S.拉孔布-Gleise等人(1995)中培養的兔軟骨細胞和成骨細胞在共培養系統(COSTAR)中,其中分離出細胞,微孔膜(0.4微米)允許沒有任何直接接觸的兩種細胞類型之間的交換。這項研究表明成骨細胞通過可溶性介質刺激軟骨細胞生長的能力。
調幅 Malfait和合著者(1994)研究了外周血和軟骨細胞單核細胞之間的關係。該模型便於研究細胞因子介導的過程,炎症性關節病(類風濕性關節炎,血清陰性脊柱炎等)。該模型的作者通過直徑為0.4μm的蛋白質結合膜分離細胞。研究發現,脂多醣刺激的單核細胞制定iFNO IL-1-A,其抑制軟骨聚集蛋白聚醣的合成,並促進了已聚集蛋白聚醣合成的聚集體的降解。
K.多田等人(1994)中創建,其中的膠原蛋白的內皮細胞(I型)的凝膠放入內腔從由放置在過濾器具有0.4微米的孔徑的軟骨細胞從中分離的外室中的共培養模型。在與外室完全隔離的狀態下,在EGF或TGF-α存在下,人內皮細胞在膠原凝膠中形成管。隨著兩種類型TGF細胞的同時培養,內皮細胞依賴形成的管被抑制。該過程的軟骨細胞抑制被抗TGF-β抗體部分消除。可以假設軟骨細胞產生的TGF-β抑制軟骨本身的血管化。
S.Groot和合著者(1994)同時從16日齡胎鼠的骨骼增生和增殖區域培養軟骨細胞與腦組織塊。培養4天后,觀察軟骨細胞向成骨細胞的轉分化和類骨質形成的發作。培養11天后,部分軟骨被骨組織取代,骨基質部分鈣化。由腦組織產生的一些神經肽和神經遞質影響成骨細胞的代謝或在其上具有受體。其中,可以分離去甲腎上腺素,血管活性腸肽, 與降鈣素基因相關的肽,P物質和生長抑素。用軟骨細胞培養,腦組織碎片可以產生這些因子中的一些,這可以誘導軟骨細胞轉分化成成骨細胞的過程。
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外界因素對軟骨細胞培養的影響
氧張力對軟骨細胞代謝的影響
在大多數情況下,軟骨細胞培養在大氣氧張力條件下發生。然而,眾所周知,體內軟骨細胞在低氧條件下存在,並且氧張力隨著不同病理條件而變化。在成熟過程中,觀察到骨骺血液供應的顯著變化。由於血管生成在生長板的不同區域中變化,所以它們中的氧張力也變化。C.Brighton和R.Heppenstall(1971)證實,在兔子的脛骨板中,肥大區的氧張力比周圍軟骨少。一些代謝參數的測量表明,軟骨細胞能夠迅速對氧濃度的局部變化作出反應。首先,低氧壓力下,軟骨細胞的消耗減少。隨著氧張力從21降低到0.04%,葡萄糖利用率增加,糖酵解酶活性和乳酸合成增加。即使氧氣壓力低,ATP,ADP和AMP的絕對量也保持穩定。這些數據表明軟骨細胞代謝的方向性以最大限度地節約能量。儘管如此,合成活動以及修復過程在缺氧條件下都會發生變化。
高氧張力也影響軟骨細胞的代謝,導致蛋白聚醣和DNA的合成減少,軟骨基質降解。這些影響通常伴隨著游離氧自由基的產生。
環境離子濃度和滲透壓對軟骨細胞功能的影響
在原生軟骨中,離子濃度與其他組織中的離子濃度顯著不同:細胞外培養基中的鈉含量為250-350mmol,其滲透壓為350-450mosmol。當從VCR中分離軟骨細胞和在標準培養基中培養它們(DMEM(Dulbecco氏最小必需培養基 - 的Dulbecco極限必需培養基)摩爾滲透壓濃度 - 250-280,7毫滲量)的變化急劇圍繞該小區的環境。另外,標準培養基中鈣和鉀的濃度遠低於天然組織,並且陰離子濃度更高。
向培養基中添加蔗糖導致其滲透壓增加並且誘導細胞溶質中H +和鈣陰離子濃度的瞬時細胞內增加。這種細胞內變化可影響軟骨細胞分化過程及其代謝活性。J. Urban等人(1993)發現的包含35 8硫酸鹽和3在標準DMEM培養基中溫育2-4小時,H-脯氨酸分離的軟骨細胞,只有10%的,在天然組織。在新分離的軟骨細胞和軟骨組織的外植體中,合成強度達到最大,細胞外培養基的滲透壓為350-400mosmol。此外,將分離的細胞置於所述滲透壓的標準DMEM培養基中後,軟骨細胞體積增加30-40%。然而,當在非生理滲透壓摩爾濃度為12-16小時培養的軟骨細胞,通過減少剪切強度適應於新環境的細胞是細胞外介質的比例合成同滲容摩。
P.博爾格蒂等人(1995)研究了生長,形態學細胞外介質的同滲容摩的效果,和豬軟骨細胞的生物合成。作者證實了在滲透壓為0.28和0.38 mosmol的培養基中培養的軟骨細胞具有類似的生物化學和形態學特徵。當觀察到在第一4-6小時培養物的培養基的0.48毫滲克分子滲透壓濃度在細胞增殖和蛋白質合成減少,但其後發生還原這些參數,最終達到控制值。當培養用0.58毫滲克分子滲透壓濃度的細胞的培養基中的軟骨細胞失去它們的支持生理強度增殖過程的能力和後6天的軟骨細胞的數量顯著減少。在培養基的滲透壓為0.58mosmol時,觀察到蛋白質合成的深度抑制。另外,培養時與摩爾滲透壓濃度媒體毫滲量0,28-0,38軟骨細胞保持在更高的同滲容摩(毫滲量0,48-0,58)細胞形態變化顯著生理表型,這表現損耗特性的表型軟骨細胞轉化進入成纖維細胞樣細胞,以及細胞喪失,裝配基質蛋白聚醣的能力。這項研究的結果表明軟骨細胞對細胞外環境中有限滲透壓振蕩的反應能力。
其他離子濃度的變化也會影響軟骨細胞生物合成的過程。因此,隨著鉀離子濃度從5mmol(標準DM DM培養基中的濃度)增加到10mmol(體內 VKM 中的濃度),35 S(硫酸鹽)的包含程度增加一半。鈣濃度低於0.5mmol有助於成熟公牛軟骨細胞產生膠原,而濃度為1-2mmol(對應於標準DM DM培養基中的濃度)導致膠原蛋白合成的顯著降低。在高水平的鈣(2-10毫摩爾)中觀察到生物合成的適度增加。各種陽離子參與軟骨細胞與VKM蛋白的附著。因此,鎂離子和錳離子提供纖連蛋白和II型膠原的附著,而鈣離子不參與軟骨細胞與蛋白質的附著。因此,所述研究的結果表明培養基的鉀,鈉,鈣和滲透壓的細胞外離子變化對在標準培養基中培養的軟骨細胞的生物合成功能的影響。
機械應力對軟骨細胞代謝的影響
關節的固定引起軟骨的可逆性萎縮,這表明對於ECM中的正常代謝過程需要機械刺激。在大多數情況下,所使用的細胞培養模型在正常大氣壓條件下存在。M. Wright和他的同事(1996)表明,機械環境影響軟骨細胞的代謝,這些細胞的響應依賴於壓縮載荷的強度和頻率。對關節軟骨的外植體完整的負荷實驗在體外表現出的蛋白和蛋白聚醣的合成的靜載荷下的降低,動態負載而刺激這些進程。用於實現對軟骨複雜的機械載荷作用的精確機制,並可能與應變細胞,靜水壓,滲透壓,電位和細胞表面受體的基質分子。為了研究每個參數的影響,有必要創建一個系統,其中一個參數可以獨立變化。例如,外植體培養不適合研究細胞變形,但可用於研究壓力對軟骨細胞代謝活動的整體影響。軟骨的壓縮導致細胞變形,並且也伴隨著的流體靜壓力梯度,電勢,和流體流動改變物理化學等因素在基質中的水含量,電荷密度,滲透壓的電平的出現。可以使用浸在瓊脂糖或膠原凝膠中的分離的軟骨細胞研究細胞變形。
已經開發了幾種系統來研究機械刺激對軟骨細胞培養的影響。一些研究人員使用這樣的系統,其中壓力通過氣相施加到細胞培養物上。例如,使用高於大氣壓的13千帕的壓力下在15分鐘期間的低頻率(0.3赫茲)JP Veldhuijzen等人(1979),觀察到cAMP合成和蛋白聚醣和降低DNA合成的增加。R. Smith等人(1996)表明,以1赫茲進行4小時的軟骨細胞公牛靜水壓力(10兆帕)的原代培養物的間歇暴露引起的聚集蛋白聚醣和II型膠原蛋白的合成的增加,而恆定的壓力對這些過程沒有影響。使用類似的系統M. Wright等人(1996)報導了在細胞培養物中的週期性壓力與細胞膜軟骨細胞和Ca的激活的超極化相關2+依賴性鉀通道。因此,循環壓力的作用是通過軟骨細胞膜中的拉伸激活的離子通道介導的。軟骨細胞對靜水壓力的反應取決於細胞培養條件和施加載荷的頻率。因此,環狀的流體靜壓(5兆帕)降低的硫酸根摻入到軟骨細胞單層在0.05,0.25和0.5 Hz的頻率的頻率,而對於大於0.5赫茲包含硫酸軟骨外植體的增加的頻率。
M.Bushmann等(1992)報導,瓊脂糖凝膠中的軟骨細胞以與培養的完整器官相同的方式響應靜態和動態機械應力而改變生物合成。作者發現,機械負荷產生高滲刺激,隨後軟骨細胞的pH值下降。
機械拉伸的效果可以在浸在凝膠中的細胞培養物上進行研究。拉伸力可以使用計算機控制的真空產生。當系統處於一定的真空度,一個培養皿的細胞的培養的底部由一個已知量,在杯底部和最小值在中心邊緣的最大變形延長。在軟骨細胞的培養皿中傳遞和培養拉伸。利用這種方法,霍爾姆-瓦爾K.等人(1995)表明,在培養的膠原(II型)凝膠軟骨肉瘤細胞中增加的mRNA和表達2 -integrina。一個2 p - [R整聯是能夠結合II型膠原。它被認為是一種機械感受器,因為它與肌動蛋白結合蛋白相互作用,從而連接ECM和細胞骨架。
PH對軟骨細胞代謝的影響
軟骨組織的ECM間質液的pH比其他組織更酸性。A. Maroudas(1980)確定關節軟骨的pH值為6.9。W. Diamant和共同作者(1966)發現病理狀態下的pH值為5.5。已知軟骨細胞生活在低氧分壓下,這表明糖酵解(總糖代謝的95%)在這些細胞代謝中的重要作用; 糖酵解伴隨著大量乳酸的產生。
除了糖酵解產物對環境的酸化之外,基質組分本身也是非常重要的。在胞外蛋白聚醣大量固定負電荷的修改的離子組成:有游離陽離子(例如H A高濃度+,鈉+,K +)和陰離子的低濃度(例如,O2,NPHS)。此外,機械負載的作用下發生的水排出來自ECM,這導致的固定負電荷濃度增加,吸引在矩陣多種陽離子。這伴隨著細胞外培養基的pH降低,其影響細胞內pH,從而改變軟骨細胞的代謝。R.威爾和A.霍爾(1995)研究了細胞外和細胞內環境的生物合成基質中分離軟骨細胞的牛的pH的影響。他們觀察到基質合成的雙重修飾伴隨著pH的降低。pH的輕微降低(7.4
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培養基組成對軟骨細胞代謝的影響
培養軟骨細胞的培養基必須符合實驗條件。近年來,小牛血清已被用於優化培養條件。但是,在使用血清時,必須考慮幾個重要的問題:
- 細胞從器官培養物組織外圍的外部生長,
- 各種系列血清組成的變異性,
- 其中存在未知組件,
- 干擾風險增加,研究各種生物因素對細胞代謝活性影響的文物。
後者的一個例子是研究EGF對大鼠軟骨軟骨細胞的作用。EGF刺激3 H-胸腺嘧啶核苷的摻入和培養物中DNA含量的增加。這種效應在低血清濃度(<1%)時更顯著,但在高濃度(> 7.5%)時效應消失。
眾所周知,與體內條件相比,富含小牛血清的DMEM中的合成和降解水平顯著增加。體內和體外代謝之間的差異可以由滑液與培養細胞的環境之間的差異引起。D. Lee等人(1997)中培養的軟骨細胞的瓊脂糖使用含有DMEM的營養培養基,含20%小牛血清和大量同種異體正常滑液的富集小公牛。培養基中滑液的存在引起蛋白聚醣數量的增加,高達滑液總量的80%。結果表明,培養液中的滑液產生與體內類似的代謝速率,具有高水平的糖胺聚醣合成和低水平的細胞分裂。
G. Verbruggen的等人(1995)表明,在合成35 S-arrpeKaHa在DMEM培養瓊脂糖的人軟骨細胞無血清在DMEM觀察到合成的水平的20-30%,在補充有10%小牛血清。作者確定了IGF-1,IGF-2,TGF-β或胰島素在無血清培養基中恢復聚集蛋白聚醣生成的程度。作者得出結論:100ng / ml胰島素,IGF-1或IGF-2部分地將聚集蛋白聚醣的合成降低至對照水平的39-53%。綜合這些因素,沒有發現協同或累積現象。與此同時,10納克/毫升,100納克/毫升胰島素存在TGF-β刺激的軟骨聚集蛋白聚醣的合成於參考電平的90%或更多。最後,血清轉鐵蛋白,單獨或與胰島素組合,不影響聚集蛋白聚醣的合成。當用牛血清白蛋白代替小牛血清時,聚集蛋白聚醣的總含量顯著降低。富集胰島素培養基的培養基,IGF或TGF-β部分恢復了細胞產生聚集蛋白聚醣聚集體的能力。在這種情況下,IGF-1和胰島素能夠維持細胞培養物的穩態。後在介質培養40天補充有10-20納克/毫升IGF-1,蛋白多醣合成保持在相同的水平或甚至更高與含20%小牛血清的介質的比較。分解代謝過程中補充有IGF-1比在補充有0.1%的白蛋白溶液中的介質介質進展緩慢,但有些在介質更快的補充有20%血清。在長期存活的培養物中,20ng / ml的IGF-1維持穩定的細胞狀態。
D. Lee等人(1993)相比,培養基的組合物的效果(DMEM,DMEM + 20%小牛血清的DMEM + 20納克/毫升IGF-1)對DNA合成中的外植體軟骨,單層培養的培養物,並懸浮在瓊脂糖。當在血清存在下在瓊脂糖中培養時,作者觀察到將軟骨細胞分為大團簇的傾向。將培養的無血清或IGF-1的細胞儲存在圓形瓊脂糖中,組裝成小組,但不形成大的聚集體。在單層中,含血清培養基中DNA的合成顯著高於富含IGF-1的培養基; 後者的DNA合成遠高於未富有的環境。當以未濃縮介質和在介質中與IGF-1,在DNA合成沒有差別培養在懸浮液中的軟骨細胞在瓊脂糖。同時培養在補充有血清的培養基的瓊脂糖軟骨細胞漿液,伴隨著放射性核苷酸的增加的摻入3 H-胸苷相比其他環境。
維生素C對於激活參與形成穩定的膠原纖維螺旋結構的酶是必需的。關於抗壞血酸缺乏的軟骨細胞合成慢性分泌的膠原的低羥基化非螺旋前體。抗壞血酸(50μg/ ml)的引入引起II型和IX型膠原蛋白的羥基化以及它們的正常量的分泌。維生素C的添加不影響蛋白聚醣的合成水平。因此,膠原蛋白的分泌獨立於蛋白聚醣的分泌來調節。