造血幹細胞

造血幹細胞（HSC），為間充質祖細胞的特徵是多能和產生的細胞系，其形成血細胞和免疫系統的一些專門的組織細胞的有限元素。

所有的血細胞的共同祖先存在的假設，以及術語“幹細胞”，由A.馬克西莫夫（1909年）所擁有的細胞團從GSK巨大的潛力形成 - 骨髓幹細胞產生的第10天的細胞組成外設本身的血細胞。造血幹細胞的存在是在造血中接收的輻射暴露的致死劑量，破壞骨髓幹細胞的小鼠中回收實驗成立於1961年。名次 即同源骨髓細胞移植所以致死照射的動物中的收件人的脾臟，其源極被檢測造血離散灶 - 單集落形成祖細胞。

然後，證明了造血幹細胞自我支持的能力，其在發育過程中提供了造血功能。在胚胎髮育過程中，HSC具有高遷移活性，這是遷移到造血器官部位所必需的。HSC的這種特性也被保留在發生中 - 由於它們不斷的遷移，發生免疫活性細胞庫的永久更新。GSK的遷移，滲透通過血液 - 組織屏障的能力，植入組織的生長和產克隆在許多與造血系統病症相關的疾病提供了一種用於骨髓移植的細胞的基礎。

像所有的幹細胞資源，造血幹細胞存在於你的極少量的利基（骨髓），這導致他們的分配一定的困難。免疫表型人HSC的特徵為能夠遷移到血液中，並殖於免疫系統的器官或重新填充骨髓基質的CD34 + NK細胞。有必要清楚地了解到GSK不是最不成熟的骨髓細胞，並從前體，其包括成纖維細胞dormantnye SB34陰性細胞來源。結果發現，與CD34的表型的細胞能夠進入血液，在這裡改變自己的CD34 +表型，但微環境的影響下，在骨髓中的返鄉再次成為CD34陰性幹細胞的元素。在休息〜CD34細胞不響應旁分泌調控信號基質（生長因子，細胞因子）。然而，在需要放大的強度造血幹細胞與所述表型CD34的情況下響應分化信號形成造血和間充質祖細胞。造血通過與骨髓基質的GSK細胞元件直接接觸來進行呈現巨噬細胞，網狀內皮細胞，成骨細胞，基質成纖維細胞和胞外基質的複雜網絡。骨髓基質框架 - 不僅是一個矩陣或“骨架”為造血組織，它攜帶由於生長因子，細胞因子和趨化因子的旁分泌調節信號造血細調節，並且還提供了所必需的血細胞的形成粘合劑的相互作用。

因此，不斷更新的造血系統的基礎是造血幹細胞，其能夠延長自我維持時間。在實施過程中，HSC經歷初步分化並形成細胞形態和免疫表型特徵不同的細胞克隆。原始和定型祖細胞的連續形成通過形成各種造血系的形態上可識別的祖先細胞來完成。複雜的多階段造血過程隨後階段的結果是細胞的成熟和成熟元素 - 紅細胞，白細胞，淋巴細胞和血小板釋放到外周血中。

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造血幹細胞的來源

造血幹細胞被認為是研究最多的干細胞來源，這主要歸因於其在臨床上用於骨髓移植。乍一看，關於這些細胞的知識很多。在一定程度上是這樣的話，由於中間和成熟後代GSK - 最實惠的細胞元件，其中的每一個（紅細胞，白細胞，淋巴細胞，單核細胞/巨噬細胞和血小板）中各級徹底研究 - 從光到電子顯微鏡，從生化和免疫表型特徵，然後通過PCR分析鑑定。然而，監測進行的形態，超微結構，生化，免疫表型和基因組GSK生物物理參數還沒有產生答案，許多疑難問題，其中解決方案是必要的細胞移植的發展。它仍然沒有建立穩定機制GSK在休眠狀態，它們被激活，進入對稱或不對稱分裂的階段，最重要的 - 因為功能不同的血細胞，紅細胞，白細胞，淋巴細胞和血小板致力於教育的。

在骨髓細胞與CD34的表型，這兩者都是間充質細胞和造血幹細胞的祖先的存在已經提出了最早的接近CD34陰性細胞中的祖細胞的分化和造血基質線的存在的問題。通過長期培養的方法，獲得了所謂的長期培養起始細胞（LTC-IC）。在集落形成基於生長因子的組合骨髓基質的活性，例如祖細胞的壽命超過5週，而在僅3週培養致力於菌落形成單位（CFU）的生存力。目前據信，該LTC-IC - 功能類似物GCW作為repopulyatsionnom在約20％LTC-IC的高電位通過表型CD34 + CD38-其特徵在於，並表現出對自我更新的高容量。人骨髓與1:50 000但是頻率發現這樣的細胞，但應認識到最接近被培養的長期（15週）的條件下獲得的HSC limfoidoinitsiiruyuschie骨髓細胞。這樣的細胞被指定為LTC，人骨髓細胞中以比LTC-IC少10倍被找到，並且被形成為骨髓細胞系和淋巴造血幹。

雖然造血幹細胞的標記的單克隆抗體，隨後的免疫表識別是用於識別並與潛在的臨床使用專用GSK的因此而受限，造血幹細胞的選擇性排序的主要方法。不可避免地排序免疫陽性期間阻斷CD34受體抗體或其它標誌物抗原改變與它分離的細胞的特性。更優選的考慮immunonegativnoe上磁列GSK選擇。然而，在這種情況下，分揀通常使用單克隆抗體，固定在金屬載體上。此外，重要的是，將基於表型GSK的分配兩者的方法，而不是功能特性。因此，許多研究人員更喜歡使用克隆形成參數GSK，它允許的尺寸和集落的組合物，以確定成熟和祖細胞的分化的方向的程度的分析。已知的是，在提交細胞的數量和類型的集落數的過程被減少。造血幹細胞和其子細胞初，被稱為“粒細胞 - 紅細胞的單核細胞megakariotsitokolonieobrazuyuschaya單元”（SFU-GEMM），創建包含分別，粒細胞，紅細胞，單核細胞和巨核培養多線性大菌落。位於線粒譜系定型monotsitokolonieobrazuyuschaya單元（SFU-GM）下面產生粒細胞和巨噬細胞，和粒細胞集落形成單位（SFU-G）的菌落 - 只有成熟粒細胞的小菌落。早期紅細胞前身 - 紅細胞burstoobrazuyuschaya單元（SFU-E） - 大且較成熟的紅細胞集落形成單位（SFU-E）的一個源 - 小紅細胞集落。在一般人群中，隨著細胞在半固體培養基的生長可以識別形成六種類型的骨髓集落的細胞：SFU-GEMM，GM-SFU，SFU-G，M-SFU，VFU-E和E-SFU）。

然而，除了造血衍生物之外，用於分離HSC的任何來源材料都含有大量的伴隨細胞。在這方面，首先需要初步純化移植物的免疫系統活性細胞。通常，基於特定抗原的淋巴細胞表達的免疫接種用於此，這使得使用單克隆抗體分離和去除它們成為可能。此外，一個技術immunorozetochnaya T淋巴細胞耗竭骨髓移植，這是基於CD4 +淋巴細胞和特異性單克隆抗體的複合物的形成使用單採有效地去除。該技術提供了具有40-60％造血幹細胞的純化細胞材料。

增加祖細胞的數量由於從白細胞分離產物中除去成熟血細胞的通過逆流離心，隨後過濾來實現（在螯合劑的存在下 - 檸檬酸三鈉）通過包含塗覆有人類免疫球蛋白尼龍纖維柱。這兩種技術的持續應用確保了血小板移植的徹底清潔，紅細胞佔89％，白細胞佔91％。由於HSC損失的顯著減少，總細胞團中CD34 +細胞的水平可以增加到50％。

對於分離的造血幹細胞的功能特徵，使用它們在培養物中產生成熟血液成分的集落的能力。對形成的菌落進行分析可以鑑定和量化祖細胞的類型，它們的作用程度並確定其分化的方向。在甲基纖維素，瓊脂，血漿或纖維蛋白凝膠上的半固體培養基中測定克隆形成活性，其降低了細胞的遷移活性，這阻止了它們附著於玻璃或塑料表面。在最佳培養條件下，來自單細胞的克隆在7-18天內發育。如果克隆中的細胞數少於50個，則如果細胞數量超過50個，則將其識別為單個簇 - 作為菌落。考慮到能夠形成菌落的細胞數量（菌落形成單位-CFU或集落形成細胞-COC）。應當注意的是，參數和CFU COC不對應於HSC在細胞懸浮液中的數目，雖然它相關與再次強調，需要確定在體外造血幹細胞的功能（菌落形成）的活性。

在骨髓細胞中，造血幹細胞具有最高的增殖潛力，因此在培養中形成最大的集落。通過這些菌落的數量，建議間接確定乾細胞的數量。體外超過0.5毫米，直徑與細胞1000的數量形成菌落後，作者已經測試了這些細胞的穩定性，以亞致死劑量5-氟尿嘧啶和檢查了它們對致死量重新填充骨髓照射動物的能力。根據這些參數，分離的細胞與HSC差別不大，並且獲得具有高增殖潛力的縮寫符號HPP-CFC-集落形成細胞。

尋找更多定性選擇造血幹細胞的可能性仍在繼續。然而，造血幹細胞在形態上與淋巴細胞相似，並且代表了一組相對均勻的細胞，具有幾乎圓形的細胞核，精細分散的染色質和少量弱嗜鹼性細胞質。確切的數字也很難確定。假定人骨髓中的GSK以每106個含核細胞1個的頻率發生。

造血幹細胞的鑑定

為了提高造血幹細胞的識別是順序進行或同時進行（對多通道脫水山梨醇TERE）抗原的研究membrannosvyazannyh光譜，其中GSK表型CD34 + CD38應與缺乏分化標記線性的，免疫活性細胞例如CD4的特別抗原和表面免疫球蛋白相結合糖蛋白。

實際上造血幹細胞表型的所有方案都包括確定CD34抗原。該分子量約為110kDa的糖蛋白攜帶數個糖基化位點，在位於第1條染色體上的相應基因活化後，在漿細胞膜上表達。CD34分子的功能與L-選擇蛋白介導的早期造血前體細胞與骨髓基質基質的相互作用有關。然而，應該記住的是，CD34抗原的細胞表面上的存在只允許使GSK在細胞懸浮液中的內容的初步評估，因為它被表達，以及其它造血祖細胞和骨髓基質細胞和內皮細胞。

在造血祖細胞的分化過程中，CD34表達永久降低。紅細胞，粒細胞和單核細胞提供的祖細胞或者弱表達CD34抗原，或者它們的表面上完全不存在（表型CD34）。在骨髓和成熟血細胞的分化細胞的表面膜上，未檢測到CD34抗原。

應當指出的是，在造血祖細胞的分化的動態不僅降低CD34的表達水平，但平行CD38抗原的表達逐漸增加 - 整合膜糖蛋白，46 kDa的具有NAD-glikogidrolaznoy和ADP-核糖基環化酶活性的分子量，表明其參與在ADP-核糖的轉運和合成中。因此，有可能對造血祖細胞的作用程度進行雙重控制。與表型CD34 + CD38 +，從90％至99％的CD34陽性的骨髓細胞的細胞群包含所述祖細胞具有有限的增殖潛能和分化，而用表型CD34 + CD38的細胞可以如權利要求中的作用GSK。

事實上，骨髓細胞群，由式CD34 + CD38-所描述的，包含相對大數量的能夠分化為骨髓和淋巴系原始幹細胞。在長期培養用CD34 + CD38-細胞的表型的上下文管理讓所有的成熟血細胞：嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜鹼性粒細胞，單核細胞，巨核細胞，紅細胞和淋巴細胞。

最近相對它發現CD34陽性細胞表達兩種多種標記 - AC133和CD90（THY-1），其也用於鑑定造血幹細胞。Thy-1抗原在骨髓，臍帶和外周血的CD34 +細胞上與CD117受體（c-kit）共表達。這是一種表面磷脂酰肌醇結合糖蛋白，分子量為25-35 kDa，參與細胞粘附過程。一些作者認為Thy-1抗原是最不成熟的CD34陽性細胞的標記。具有表型CD34 + Thy-1 +的自我繁殖細胞產生長形培養系，形成子細胞。建議Thy-1抗原阻斷導致細胞分裂停止的調節信號。儘管CD34 + TU1 +細胞能夠自我更新和長期培養的線的創建，它們的表型不能僅僅涉及HSC，如THY-1中的CD34陽性細胞的元件的總重量+含量為約50％，遠遠超過了造血細胞的數量。

鑑定造血幹細胞的更有希望的是AC133，它是造血祖細胞的抗原標記，其表達首先在胚胎肝細胞上檢測到。AC133是在GSK成熟早期階段出現在細胞膜表面的跨膜糖蛋白 - 甚至可能比抗原CD34早。在A.Petrenko和V.Grishchenko（2003）的研究中，發現AC133表達高達30％的胚胎肝CD34陽性細胞。

因此，造血幹細胞通過今天概念必須存在CD34的理想表型譜，細胞輪廓的總和，在電路中的抗原結構，AC133和THY-1，但存在用於分子突起CD38沒有地方，HLA-DR和標記線性分化GPA ，CD3，CD4，CD8，CD10，CD14，CD16，CD19，CD20。

GSK表型變異肖像可以是CD34 + CD45RalowCD71low的組合，因為由該式所描述的細胞的性質不從與所述表型CD34 + CD38細胞的功能參數是不同的。另外，人HSC可通過表型標誌CD34 + THY-L + CD38Iow /'的c-kit /低來識別 - 只有這些細胞30在致死照射的小鼠中完全還原造血作用。

從骨髓細胞的總表型特徵分析其實已經開始40多年的潛心研究GSK同時具有自我更新和分化到其他細胞成分，從而證明了使用骨髓移植來治療造血系統的各種病症。最近發現的新型乾細胞尚未在臨床實踐中廣泛使用。然而，源於臍帶（線）的血液和胎兒肝臟可以顯著擴大細胞移植不僅在血液學，而且在醫藥等領域，從HSC骨髓不同作為定量的性能和質量特徵的細胞。

移植所需的干細胞造血細胞量通常從骨髓，外周血和臍帶血以及胚胎肝獲得。此外，造血祖細胞可以通過胚胎幹細胞的增殖以及隨後定向分化為造血細胞成分而體外獲得。A.彼得連科，五Grishchenko（2003）正確地指出顯著差異免疫學特性和恢復造血GSK不同的產地，由於提前包含在其多能性的來源不平等比後來定向祖細胞的能力。另外，來自不同幹源的造血幹細胞在數量和質量上都具有完全不同的非造血細胞相關性。

造血幹細胞的傳統來源是骨髓。在局部麻醉下通過浸出從腹部骨或胸骨獲得骨髓細胞懸浮液。由此獲得的懸浮液是非均質的並且含有HSC，基質細胞成分，骨髓和淋巴系的定向祖細胞以及成熟血液成分的混合物。骨髓單個核細胞中具有表型CD34 +和CD34 + CD38的細胞數目分別為0.5至3.6和0至0.5％。G-CSF誘導的HSC動員後的外周血含有0.4-1.6％的CD34 +和0-0.4％的CD34 + CD38。

造血胎兒肝細胞中檢測和0-0.6 OD-2.6％，並且它們的最大數目 - - 與CD34 + CD38免疫表型和CD34 +臍帶血細胞的比例更高和2,3- 0,2-12,5 -35.8％。

但是，移植物材料的質量不僅取決於包含CD34 +細胞在其中的量，還取決於它們的功能活性，這可通過集落形成體內水平（骨髓再增殖在致死劑量照射動物）被估計，並且在體外 - 上半固體培養基菌落的生長的。結果發現，在集落形成和與表型CD34 + CD38 HLA-DR，從胎兒肝臟，胎兒骨髓和臍帶血分離的造血祖細胞的增殖活性，並大大超過成年人的骨髓和外周血的造血集落形成細胞的增殖能力。GSK不同來源的定量和定性的分析顯示，在細胞懸液的相對含量和功能的顯著差異。在從胎兒骨髓衍生的移植材料觀察到的CD34 +細胞（24.6％）的最大數目。成人的骨髓含有2.1％的CD34陽性細胞成分。之間的人類成人外周血單核細胞只有0.5％有表型CD34 +，而臍帶血其量達到2％。因此菌落2.7倍形成CD34 +胎兒骨髓的細胞的能力超過成人細胞和臍帶血細胞形成比從成人的外周血中分離出的造血元件大得多的菌落造血骨髓的克隆生長的能力：65.5至40和，分別為8個菌落/ 105個細胞。

在增殖活性和造血幹細胞的集落形成能力的差異不僅具有不同程度的成熟有關，但也與它們的天然的微環境。已知的是，增殖和幹細胞分化的強度速度通過生長因子和細胞因子的多組分體系是由兩個幹細胞和基質的基質微環境的細胞成分產生的積分調控影響來確定。使用純化的細胞群體和無血清培養基中，以細胞培養物給予具有在各個層次上，祖細胞和細胞的提交到一個特定直線方向的幹細胞的刺激和抑制效應表徵的生長因子。所進行的研究結果令人信服地證明，從具有不同發育水平的來源獲得的GSK在表型和功能上均不同。對於GSK來說，停留在個體發育的早期階段，其特徵在於自我繁殖和高增殖活性的高潛力。這種細胞以較長的端粒長度為特徵，並且經歷所有造血細胞系的形成。由於此類細胞輕度表達HLA分子，因此免疫系統對HSC胚胎起源的反應被延遲。有造血幹細胞的相對含量的明顯灰度及其能力自我更新和它們形成類型承諾的行數：胎兒肝臟的CD34 +細胞>臍帶血CD34 +細胞>骨髓的CD34 +細胞。增生性骨髓或成人外周血，反比於捐贈者的年齡得到的造血幹細胞集落形成活性 - 這些分歧並非只在區域內和新postanatalnomu人類發展的早期階段，而且在整個個體發育是很重要的。