非病毒基因疗法为慢性腰背痛带来希望

在最近发表在《生物材料》杂志上的一项研究中，研究人员开发了一种新型非病毒基因疗法，通过使用工程化的细胞外囊泡 (eEV) 将转录因子 Forkhead Box F1 (FOXF1) 输送到体内退变椎间盘 (IVD) 中，来治疗椎间盘源性背痛 (DBP)。

由于人口老龄化和阿片类药物滥用问题日益严重，慢性腰痛(LBP) 已成为一个日益严重的全球性问题。目前的治疗方法包括短期缓解或昂贵的手术，这凸显了对非成瘾性、微创疗法的需求。

目前的生物学方法，包括生长因子注射、细胞疗法和病毒基因疗法，可以减轻动物和人类模型中的退化。然而，短期效应、长期疗效不佳以及不必要的免疫原性和致癌性等问题可能会阻碍这些方法的直接应用。

在这项研究中，研究人员利用FOXF1-eEV建立了一种针对椎间盘退变（IVD）的非病毒基因治疗方法。

研究人员用含有 FOXF1 或 pCMV6 的质粒转染原代小鼠胚胎成纤维细胞 (PMEF) 作为对照，并使用纳米粒子追踪分析 (NTA) 对 eEV 样本进行表征。

他们利用定量逆转录聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 和常规 PCR 评估了分子货物有效装载到 eEV 中的能力。Western blot 分析鉴定了 eEV 形成过程中的 FOXF1 和 EV 特异性蛋白。该团队利用增强上下多聚接头区域的质粒，确定了供体细胞和生成的 eEV 中 FOXF1 质粒 DNA 的存在。

他们检查了 eEV 和供体细胞中质粒 DNA 产生的全长 mRNA。

研究人员创建了含有转录因子的细胞外囊泡，以恢复 DBP 动物模型中的组织功能并改变疼痛反应。

他们在患有椎间盘源性背痛的小鼠模型中，鉴定出可将 FOXF1 运输和分布到受损椎间盘的 EV，以确定 FOXF1 eEV 对椎间盘退变的抑制作用。

该团队将小鼠椎间盘的生物力学测试与成像、细胞外基质 (ECM) 变化和 12 周后评估的疼痛反应相结合，以确认治疗干预引起的结构和功能变化以及疼痛。

术前和术后疼痛评估包括微型计算机断层扫描 (micro-CT)、磁共振成像 (MRI)、机械测试、阿尔新蓝 (AB) 和苦味天狼星红 (PSR) 染色、二甲基亚甲蓝测试和免疫组织化学 (IHC)。

该研究涉及一种手术技术，研究人员给小鼠皮下注射丁丙诺啡缓释剂来控制术后疼痛。

研究小组在手术前以及手术后 4 至 12 周每两周进行一次行为评估，采用多种方法，包括旷场测试、冷板、尾悬和钢丝悬吊。

旷场试验评估小鼠的自发活动；冷板试验测量热痛觉过敏；悬尾试验测量轴向疼痛；悬线试验测量力量。

手术12周后，研究团队利用股神经和动脉示踪技术解剖了动物的腰椎，以识别L4和L5、L5和L6以及L6和S1椎间盘之间的椎间盘。他们利用L5/L6椎间盘评估组织学并测定糖胺聚糖(GAG)的含量。

FOXF1 eEVs 显著减轻了疼痛反应，同时恢复了 IVD 结构和功能，包括改善了椎间盘高度、组织水合、蛋白多糖含量和机械性能。

该研究重点研究了转染转录因子FOXF1的原代成纤维细胞释放载有FOXF1的eEV的情况。定量RT-PCR检测显示，与pCMV6转染的细胞相比，转染后的细胞中FOXF1 mRNA转录水平和全长转录的FOXF1 mRNA水平显著升高。

FOXF1 eEV 疗法可减轻小鼠腰椎间盘穿刺模型中的疼痛反应，效果长达 12 周。FOXF1 治疗组雌性小鼠的癫痫发作时间比损伤组更长，且在治疗后至少持续 12 周。

FOXF1 eEV 疗法改善了体内受伤和退化动物的 IVD 组织水合和高度，同时维持了水合水平和 IVD 椎间盘 T2 加权图像强度。

然而，研究小组观察到受伤动物和接受 pCMV6 eEV 治疗的动物的椎间盘高度有所降低。接受 FOXF1 eEV 治疗的小鼠在治疗 12 周后椎间盘高度没有降低。性别不影响功能结果。

FOXF1 eEVs 可修复体内受损和退化的 IVD 的机械功能。在轴向应力作用下，经 FOXF1 eEVs 处理的 IVD 比受损 IVD 表现出更高的标准化 NZ 刚度。

在蠕变条件下，受损的 IVD 表现出增加的标准化蠕变位移，表明标准化蠕变弹性刚度降低。

结果表明，降低受损 IVD 中的 GAG 含量可增加机械柔韧性，但 eEV 疗法可防止糖胺聚糖的流失以及随后的机械功能变化。

FOXF1 eEVs 通过增加蛋白多糖和 GAG 水平来诱导 IVD 的结构和功能变化。

研究结果表明，装载有发育转录因子的eEV可以通过IVD将这些转录因子递送到退行性和疼痛性关节中，从而治疗DBP等疼痛性关节疾病。

这种策略可能有助于减少疾病引起的结构和功能异常，并以性别特有的方式调节疼痛反应。

研究人员还建议使用FOXF1等发育转录因子，在体内将退化的神经髓鞘细胞转变为促合成代谢状态。其治疗效果尚需进一步研究。